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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pela revisão ética animal apropriada.
1. Preparação de Tecido Retiniano (2 h)
NOTE: Todos os procedimentos nesta seção devem ser executados sob iluminação vermelha fraca
- Animais de adaptação escura por pelo menos 1 h antes da dissecação. Execute todos os procedimentos sob iluminação vermelha fraca.
- Eutanasiar os animais por CO2 asfixia e enuclear os globos oculares em uma placa de Petri com solução extracelular previamente oxigenada.
- Pique a córnea com uma agulha e corte-a cortando-a com uma tesoura oftálmica na borda da córnea e da esclera.
- Remova a lente usando uma pinça #5. Faça suavemente um rasgo na esclera com a pinça e corte o nervo óptico onde a retina e a esclera se encontram. Termine cuidadosamente de remover a esclera da retina.
- Remova o vítreo transparente usando uma pinça #5; Uma vez removido, o vítreo aparece como uma substância gelatinosa presa à pinça. Corte as retinas ao meio (de modo que haja 4 pedaços/animal) e armazene-as em solução extracelular oxigenada em RT até o uso.
- Quando estiver pronto para montar o tecido na câmara de registro, coloque um pedaço de retina para incubar em solução enzimática diluída em 500 μL de solução extracelular oxigenada. Incubar em uma placa de Petri por 2 min em temperatura ambiente (RT) em um shaker.
- Lave o pedaço de retina em solução extracelular oxigenada e coloque o tecido em uma câmara de gravação com fundo de vidro; use uma pipeta de transferência de plástico com a ponta cortada para permitir que a retina seja transferida sem causar danos ao tecido.
- Use uma pinça para achatar cuidadosamente o tecido com a camada fotorreceptora voltada para baixo. Remova o excesso de líquido usando uma pipeta. Ancore o tecido usando um anel de platina com malha de nylon.
NOTE: Este método também pode ser usado para preparar o tecido para o isolamento de RNA de células amácrinas e bipolares marcadas. - Encha a câmara com solução extracelular oxigenada e monte-a em um estágio de microscópio. Perfundir tecido com solução extracelular oxigenada a 2-4 mL/min.
3. Visualização e direcionamento de células ganglionares da retina GFP+ (10 min)
NOTA: Todos os procedimentos nesta seção devem ser executados sob iluminação vermelha fraca
- Antes de começar, puxe micropipetas de vidro (diâmetro externo [OD]: 1,2 mm, diâmetro interno [ID]: 0,69 mm) para registros eletrofisiológicos usando um extrator de micropipetas. Use o seguinte protocolo para os eletrodos (observe que os parâmetros devem ser ajustados de acordo para atingir a resistência desejada e variam entre extratores e com vidros diferentes): Calor: Rampa +10; Puxar: 0; Vel: 23; Atraso: 1; Pressão: 500; Loop do programa: 5 vezes. Certifique-se de que as pontas tenham ~ 1 μm de diâmetro, com resistências de 2-4 MΩ para atingir células grandes e de 5-7 MΩ para atingir células menores.
- Observe a camada de células ganglionares usando a óptica de contraste de interferência diferencial infravermelho (IR-DIC) (Figura 1A). Identifique a proteína fluorescente verde (GFP) + células ganglionares da retina (RGCs) usando epifluorescência (~ 480 nm) (Figura 1B).
- Localize a pipeta cheia de solução intracelular em DIC. Aplique uma leve pressão positiva e zero voltage deslocamentos no amplificador.
- Pressione a micropipeta de vidro contra uma célula GFP+ e aplique pressão negativa para formar uma vedação GΩ entre a pipeta e a membrana celular. Aplique as etapas do comando de tensão de teste (e.g., 5 mV) para monitorar a resistência da vedação. Depois de formar uma vedação estável, rompa a membrana aplicando breves pulsos de pressão negativa para obter acesso a toda a célula.
- Aguarde 1-2 minutos para que os dendritos da célula se encham com o marcador fluorescente.
NOTE: A célula pode ser tipificada morfologicamente examinando a morfologia em epifluorescência (Figura 1C). No caso de RGCs que expressam melanopsina, a estratificação dendrítica na camada plexiforme interna é visualizada examinando os dendritos preenchidos com traçador fluorescente sob iluminação epifluorescente e determinando se eles estratificam longe do soma na sublâmina OFF (M1 ipRGCs), perto da camada de células ganglionares na sublâmina ON (M2 e M4 ipRGCs) ou ambos (M3 ipRGCs). Essa observação, combinada com o tamanho do soma (os M4s têm somas distintamente grandes em comparação com todos os outros subtipos de ipRGC), permite a identificação do tipo de célula. Assim, esta técnica permite a identificação do tipo de célula in vitro antes do isolamento do RNA. Este método pode ser modificado para outros protocolos de identificação de tipo de célula envolvendo morfologia dendrítica ou fisiologia celular.
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