Imagem de fotoativação de fluorescência do transporte de neurofilamentos em axônios mielinizados de camundongos

Resumo

Source: Boyer, N. P. et. al., Imagem e análise do transporte de neurofilamentos no nervo tibial de camundongo excisado. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra o método de fotoativação por fluorescência para analisar o transporte de neurofilamentos em axônios mielinizados de nervos periféricos. Ao rastrear neurofilamentos marcados com fluoróforo verde fotoativado, a técnica fornece informações sobre o transporte axonal em doenças neurodegenerativas.

Protocolo

<

p style='line-height:1.38000000000000001;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;text-align:justify;' dir='ltr'>Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação de solução salina nervosa

1. Faça 100 mL de solução salina de Breuer: 98 mM de cloreto de sódio (NaCl), 1 mM de cloreto de potássio (KCl), 2 mM de di-hidrogenofosfato de potássio (KH₂PO₄), 1 mM de sulfato de magnésio (MgSO₄), cloreto de cálcio de 1,5 mM (CaCl₂), 5,6% D-glicose, 23,8 mM de bicarbonato de sódio (NaHCO₃) em água bidestilada
2. Borbulhe 95% de oxigênio/5% de dióxido de carbono (carbogênio) através da solução salina por pelo menos 30 minutos antes de usar. A sobra de solução salina pode ser reutilizada dentro de uma semana; no entanto, deve ser reoxigenado antes de cada uso.
3. Despeje solução salina oxigenada em uma seringa de 60 mL e certifique-se de que haja o mínimo de ar restante na seringa.

2. Montagem inicial da câmara de perfusão nervosa

1. Conecte a seringa e o tubo conforme mostrado em Figura 1A, colocando o tubo de saída em um frasco de resíduos.
2. Coloque a junta externa no alojamento da câmara de perfusão, certificando-se de que os postes de entrada e saída do fluxo estejam alinhados com os orifícios da junta.
3. Coloque a junta interna (silicone, 100 μm de espessura) em uma lamínula circular #1.5 (40 mm de diâmetro), alisando cuidadosamente quaisquer rugas na junta para garantir uma vedação firme. Para facilitar a montagem posterior, coloque a lamínula e a gaxeta em uma toalha de papel ou lenço de tarefas com a gaxeta voltada para cima.

3. Dissecção e preparação do nervo tibial de camundongo

1. Sacrificar o animal por inalação de dióxido de carbono ou outro método aprovado institucionalmente. Inicie um cronômetro quando o animal parar de se mover/respirar, pois os experimentos só devem ser realizados dentro de 3 horas após o sacrifício.
2. Pulverize o pelo com etanol 70% e remova o máximo possível das pernas e costas do animal usando um barbeador elétrico.
3. Usando uma tesoura de dissecção grande, faça uma incisão dorsal na pele perto do meio da coluna e continue o corte ao redor do aspecto ventral do animal. A partir deste corte, reflita lentamente a pele das pernas, puxando-a suavemente para longe do músculo e cortando a fáscia.
4. Coloque o animal em decúbito dorsal em uma bandeja de dissecção e prenda as quatro patas. Opcionalmente, prenda a cauda para reduzir ainda mais o movimento.
5. Usando uma tesoura de microdissecação, faça uma incisão nos músculos da coxa a meio caminho entre a cauda e o joelho para expor o nervo ciático. Certifique-se de que o nervo, que é visível através do músculo, não seja cortado.
6. Estenda a incisão dorsal e ventralmente para remover o músculo. Da mesma forma, remova os músculos da panturrilha, mantendo os cortes superficiais e curtos para evitar danos aos nervos.
7. Remova os músculos até que o nervo tibial esteja totalmente exposto do ponto em que se ramifica do nervo ciático (no joelho) até o calcanhar (Figura 2A).
   NOTE: Em todas as etapas, incluindo e após a dissecção do nervo tibial, evite a exposição desnecessária à luz ambiente para minimizar a possível ativação incidental da proteína fluorescente verde fotoativável (paGFP) no nervo.
8. Segure o nervo tibial na extremidade proximal da coluna com uma pinça e corte o nervo usando uma tesoura de microdissecação. Tomando cuidado para não colocar tensão no nervo, levante-o para longe do músculo, cortando quaisquer anexos.
9. Corte a extremidade espinhal-distal do nervo tibial e transfira para uma pequena placa de Petri de solução salina oxigenada em temperatura ambiente. Deste ponto em diante no procedimento, certifique-se sempre de acompanhar as extremidades proximal e distal do nervo.
   NOTE: Uma maneira de fazer isso é marcar a extremidade distal do nervo com um corte angular de modo que a conicidade seja visível.
10. Começando pela extremidade proximal do nervo, segure suavemente as extremidades expostas do axônio com um par de pinças de ponta muito fina.
11. Com um segundo par de pinças, segure a bainha nervosa proximalmente e puxe lentamente em direção à extremidade distal do nervo. A bainha nervosa deslizará ao longo dos axônios com resistência mínima. Certifique-se de que nenhuma tensão indevida seja aplicada ao nervo durante este processo.

4. Conjunto final da câmara de perfusão nervosa<

ol style='margin-bottom:0; margem superior: 0; início em linha: 48px;' >

Segurando a extremidade proximal do nervo, remova-o da solução salina e coloque-o lentamente na lamínula da câmara de perfusão dentro da abertura retangular da junta interna, mantendo uma tensão suave no nervo enquanto o coloca para que fique reto.

Coloque a corrediça do microaqueduto sobre o nervo com o lado ranhurado voltado para o nervo e a direção do fluxo paralela ao nervo. Vire a lamínula e o conjunto do microaqueduto e coloque-o dentro do invólucro da câmara de perfusão com a lâmina do microaqueduto encostada à junta externa. O nervo e a junta interna circundante agora serão imprensados entre a lamínula e a lâmina do microaqueduto, que são separadas pela junta, com a lamínula voltada para cima (Figura 1B).

Prenda a câmara de perfusão colocando-a no invólucro de metal e girando o anel de travamento. Certifique-se de que o invólucro de plástico esteja totalmente sob todos os clipes de metal e aperte bem para evitar vazamento de solução salina. O aperto excessivo pode rachar a corrediça do microaqueduto ou a lamínula. Vire a câmara de forma que a lamínula fique voltada para baixo.

Pressione lentamente o êmbolo da seringa salina para encher a câmara de perfusão. Mantenha a tubulação de entrada e saída, o frasco de saída e a seringa elevados acima da própria câmara o tempo todo durante a configuração e a imagem. Isso evita o sifonamento, que pode introduzir bolhas ou causar instabilidade de foco devido à pressão negativa na câmara.

Transfira o conjunto de perfusão para um microscópio invertido stage e monte a seringa salina na bomba da seringa. Ligue o motor a uma velocidade apropriada para uma vazão de 0.25 mL/min. Em seguida, conecte e ligue o aquecedor de solução em linha ajustado para 37 °C.

Conecte o aquecedor da objetiva e ajuste para 37 °C, aplique óleo na objetiva e insira a câmara de perfusão no stage montagem.

Aplique óleo na almofada do aquecedor da câmara e conecte à câmara de perfusão. Conecte e ligue o aquecedor da câmara; regulado para 37 °C.
NOTE: Mudanças na temperatura podem causar a formação de bolhas na câmara de perfusão devido à liberação de gases da solução. Se formarem bolhas, aumente brevemente a taxa de fluxo da solução em 5-10x até que as bolhas desminem a câmara.

Trave a câmara de perfusão no adaptador de platina e coloque o óleo da objetiva em contato com a lamínula na parte inferior da câmara.
NOTE: A câmara Bioptechs com adaptador de platina ASI usada aqui é projetada para uma configuração de microscópio invertido.

5. Ativação de fluorescência e aquisição de imagem

1. Usando iluminação de campo claro, concentre-se na camada de axônios na superfície inferior do nervo mais próxima da superfície da lamínula (Figura 2B). Os axônios mielinizados (normalmente de 1 a 6 μm de diâmetro em camundongos adultos) podem ser identificados pela presença de uma bainha de mielina, que é visível sob iluminação de luz transmitida de campo claro sem realce de contraste. As fendas de Schmidt-Lanterman e os nós de Ranvier também são facilmente aparentes. Os axônios não mielinizados são mais delgados (tipicamente <1 μm de diâmetro) e geralmente estão presentes em feixes (feixes de Remak), onde geralmente são muito próximos para serem resolvidos um do outro.
2. Se disponível no microscópio, ative o sistema de foco automático para manter o foco ao longo da imagem de lapso de tempo.
3. Adquira uma imagem de referência de campo claro. Registre a orientação do nervo (extremidades proximal e distal da coluna) em relação às imagens.
4. Adquira uma imagem confocal usando um laser de 488 nm e um filtro de emissão apropriado para paGFP (por exemplo, 525/50 nm) para registrar a autofluorescência pré-branqueamento. Mantenha a potência do laser baixa para minimizar o fotobranqueamento, com o tempo de exposição ajustado de acordo para detectar o sinal fraco. Como exemplo, dados representativos foram adquiridos com 5% de potência do laser e exposições de 4 s. Registre as configurações de aquisição para uso em todos os experimentos futuros.
   NOTE: Após a fotoativação, as configurações ideais de imagem produzirão uma relação sinal-ruído > 8 e fotobranqueamento de menos de 25% do sinal original ao longo de 20 imagens. Os axônios também podem ser visualizados por microscopia de epifluorescência de campo amplo, como fizemos originalmente, mas a qualidade da imagem será inferior devido à falta de confocalidade.
5. Defina a potência do laser para aproximadamente 5x a potência normal de imagem e adquira uma imagem com um tempo de exposição de 3-4 minutos. Embora não seja essencial, esta etapa é recomendada para branquear a autofluorescência e outras fontes de fluorescência indesejada, a fim de reduzir o sinal de fundo e, assim, maximizar a relação sinal-ruído da fluorescência fotoativada.
6. Adquira uma imagem com as configurações usadas na etapa 5.4 para registrar a autofluorescência de pré-ativação após esta etapa de branqueamento.
7. Na imagem de campo claro, desenhe uma linha paralela aos axônios com um comprimento igual ao tamanho desejado da janela de ativação. O comprimento desta janela varia de acordo com o objetivo experimental e os parâmetros, mas os comprimentos típicos são 5 μm para o paradigma de escape de pulso e 40 μm para o paradigma de propagação de pulso.
8. Usando esta linha como guia, desenhe uma região retangular de interesse (ROI) através do campo de visão perpendicular aos axônios. A região deve abranger todos os axônios a serem fotoativados.
9. Determine as configurações ideais para fotoativação com iluminação de 405 nm.
   NOTE: Execute esta etapa e as subetapas apenas antes da primeira ativação experimental. Ao longo de um experimento, as mesmas configurações de fotoativação devem ser usadas.
   1. Ative uma região de interesse repetidamente usando a linha de laser de 405 nm, baixa potência do laser (por exemplo, 5%) e tempo de permanência em pixels (por exemplo, 40 μs) e um pulso, adquirindo uma imagem da proteína fluorescente verde ativada ou fluorescência GFP após cada ativação. Repita até que a fluorescência não aumente mais e, em seguida, quantifique a fluorescência em uma região de interesse para cada imagem.
   2. Plote as intensidades médias de fluorescência versus o número de pulsos. Selecione o número de pulsos após os quais a fluorescência não aumenta mais como o número ideal de pulsos para ativação.
10. Ativar a fluorescência paGFP na região desenhada no passo 5.8 por excitação padronizada com luz de 405 nm. Certifique-se de que uma imagem seja adquirida imediatamente antes e logo após a ativação.
    NOTE: A ativação ideal da PAFgP produzirá uma região claramente definida de fluorescência com limites nítidos contidos na região de interesse ou ROI.
11. Inicie um cronômetro de 1 minuto quando a ativação terminar. Ao final de 1 minuto, inicie a aquisição de uma série de timelapse.
    NOTE: O atraso de 1 minuto é necessário para permitir o aumento da fluorescência observado após a fotoativação da paGFP. Para o método de propagação por impulso, um período de aquisição de 5 a 10 minutos com intervalos de lapso de tempo de 30 segundos é suficiente para a medição das inclinações iniciais nas janelas central e flanqueadora para medir a velocidade e a direcionalidade. Para o método de escape de pulso, um período de aquisição de 30-150 minutos com intervalos de lapso de tempo de 5 ou 10 minutos permite a análise do comportamento de pausa de longo prazo dos filamentos.
12. Salve todas as imagens adquiridas, bem como o ROI usado para ativação de fluorescência.
13. Mova-se para uma nova região do nervo e repita as etapas 5.1-5.11. Se a nova região estiver ao longo do mesmo axônio, ela deve estar a pelo menos 500 μm da região ativada anteriormente para evitar a detecção de neurofilamentos fluorescentes que se moveram para fora da outra região ativada. A aquisição do timelapse final deve terminar antes do final da janela de 3 horas.
    NOTE: É possível que a preparação seja viável por mais de 3 horas, mas não confirmamos isso. Com dissecção e preparação proficientes, entre cinco e oito conjuntos de imagens de lapso de tempo de 10 minutos podem ser adquiridos dentro dessa janela de 3 horas.
14. Após a aquisição da série final de imagens de lapso de tempo, interrompa o fluxo de solução salina, desconecte a solução e os aquecedores da câmara e remova o aparelho de perfusão do estágio do microscópio.

Resultados

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
14 x 22 Junta retangular 0.1mm	Bioptechs	1907-1422-100	Inner gasket
2-desoxi-D-glicose	Sigma	D6134
30mm Junta redonda com furos	Bioptechs	1907-08-750	Outer gasket
35 x 10 mm prato	Thermo Fisher	153066	Dissection dishes
lamínulas redondas de 40 mm	Bioptechs	40-1313-0319
Seringa de 60mL - Ponta Luer-lock	BD	309653
Andor Revolution WD sistema confocal de disco giratório	Andor		Equipado com sistemas Perfect Focus e FRAPPA
Cloreto de cálcio	Fisher	C79
Coverslips	Fisher	12-541-B	Para slide de fluoresceína
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
Dissecando pinos	Fine Science Tools	26001-70
Pinça de dissecação	Fine Science Tools	11251-30	Pinça de ponta fina
Dissection microscope	Zeiss	47 50 03
Panela de dissecação com cera	Ginsberg Scientific	568859
Tesoura de dissecação	Fine Science Tools	14061-09	Tesoura de dissecção inicial
FCS2 câmara de perfusão	Bioptechs	60319-02-03
Fluoresceína sódica	Fluka	46960
Inline solution heater	Warner Instruments	SH27-B
Pinça de laminectomia	Fine Science Tools	11223-20	Pinça de dissecção inicial
Sulfato de magnésio	Sigma-Aldrich	M7506
Microaqueduct	Bioptechs	130119-5
Lâminas de microscópio	Fisher	12-544-3	Para slide de fluoresceína
Inserção do estágio do microscópio	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
Sistema de aquecimento objetivo	Okolab		Oko Touch com colarinho objetivo
Objective oil - type A	Nikon	descontinuado
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objetivo	Nikon	MRD01901
Cloreto de potássio	Fisher	P217
Fosfato de potássio	Sigma-Aldrich	P0662
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S6297
Cloreto de sódio	Sigma-Aldrich	S7653
Bomba de seringa	Sage Instruments	Model 355
Adaptador de tubulação - fêmea	Small Parts Inc.	1005109
Adaptador de tubulação - macho	Small Parts Inc.	1005012
Tubulação Tygon	Bioptechs		ID de 1/16", espessura da parede de 1/32<
Vannas spring scissors	Ferramentas de ciências finas	15018-10	fine scissors

slidetr style='height:21px;'>