Microscopia de dois fótons para imagem da morfologia neuronal em um filhote de camundongo

Resumo

Source: Mizuno, H., et al. In Vivo Imagem de dois fótons de neurônios corticais em camundongos neonatais. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo mostra a microscopia de dois fótons sendo usada para obter imagens de neurônios no cérebro de um filhote de camundongo transgênico anestesiado. O laser de dois fótons permite imagens mais profundas com alta resolução espacial e dispersão mínima de luz, permitindo a captura detalhada da morfologia neuronal, incluindo projeções dendríticas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo veterinário JoVE placa de revisão.

1. Preparação da janela craniana

1. Anestesiar o filhote com isoflurano (1,0% - 2,0%) e verificar o nível de anestesia por um teste de pinça de cauda.
2. Abra cuidadosamente o crânio com uma lâmina de barbear esterilizada, deixando a dura-máter intacta (1 mm de diâmetro) (Figura 1C). Use uma esponja de gelatina (cortada em pedaços pequenos, aproximadamente < 2 mm3, usando uma tesoura esterilizada, e aplique-os com uma pinça) embebida em tampão córtex (125 mmol / L NaCl, 5 mmol / L KCl, 10 mmol / L glicose, 10 mmol / L HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil) piperazina-1-etanossulfônico), 2 mmol / L CaCl < span style = 'font-family: Roboto, sans-serif; font-size: 0.6em; font-style: normal; font-variant: normal; font-weight: 400; text-decoration: none; vertical-align: baseline; espaço em branco: pré-wrap; '> ₂ e 2 mmol/L MgSO₄; pH 7,4; 300 mOsm/L; temperatura ambiente) para parar o sangramento. Ao abrir o crânio, aplique um tampão de córtex para manter a superfície do cérebro úmida.
3. Usando uma esponja de gelatina, remova qualquer tampão e sangue da superfície dural. Usando pontas amarelas, aplique uma fina camada de agarose de baixo ponto de fusão a 1,0% (dissolvida no tampão do córtex). Usando uma máquina de bloqueio de calor, mantenha a temperatura da solução de agarose a 42 ° C até a aplicação.
   NOTA: A drenagem do tampão e do sangue deve ser realizada do lado da craniotomia, tomando cuidado para que a esponja de gelatina seca não entre em contato com a dura-máter. Não fazer isso pode danificar a dura-máter.
4. Aplique uma lamínula de vidro redonda (nº 1, 3 mm de diâmetro) sobre a camada de gel de agarose. Remova todas as bolhas entre a lamínula e a camada de gel de agarose despejando um excesso de gel de agarose entre elas. Remova o excesso de gel que se projeta sob a lamínula usando uma pinça (Figura 1D e1E).
5. Prenda a lamínula usando cimento dental (Figura 1F).
6. Misture o pó de cimento e o líquido de cimento. Aplique a mistura com pontas amarelas antes que se solidifique. Não aplique cimento dentário na dura-máter, pois isso pode danificar o cérebro.
7. Anexe uma barra de titânio estéril (feita sob medida, aproximadamente 30 mg, consulte Figura 1G) no osso craniano com cimento dentário. Alinhe a barra de titânio e a lamínula (na superfície da dura-máter) em paralelo para capturar imagens facilmente.
8. Cubra o crânio exposto com cimento dental (Figura 1H).
9. Recupere o filhote da anestesia. Mantenha-o em um aquecedor (37 °C) até que o cimento dentário tenha solidificado (1 h).

2. Imagem de dois fótons

1. Defina o comprimento de onda do laser de dois fótons. Para excitação RFP (proteína fluorescente vermelha), use 1.000 nm (450 mW/mm2 a 400 μm de profundidade).
   NOTA: O poder do laser deve ser reduzido à medida que a posição z se move para cima.
2. Limpe a superfície da lamínula com etanol a 70%.
3. Anestesie o filhote com isoflurano (1,5% - 2,0%) e verifique o nível de anestesia usando um teste de pinça de cauda.
4. Prenda o filhote à placa de titânio no estágio de imagem usando uma barra de titânio na cabeça do filhote (Figura 2A and 2B). Ajuste a cabeça de forma que a lamínula fique paralela à lente objetiva usando o estágio do goniômetro (Figura 2B). Mantenha a temperatura corporal do filhote usando uma almofada de aquecimento (37 °C).
5. Defina a concentração de isoflurano para 0,7% - 1,0%.
   NOTE: Uma concentração muito alta de isoflurano pode causar morte acidental do filhote durante a imagem.
6. Coloque o estágio de imagem sob a lente objetiva (20X, NA 1.0) do microscópio de dois fótons (Figura 2B and 2C).
7. Aplique uma gota de água na lamínula. Use epifluorescência para localizar os neurônios marcados com proteínas fluorescentes na área onde a dura-máter foi exposta.
8. Adquira imagens de pilha z em intervalos de 1,4 μm. Para imagens de neurônios da camada 4, defina a largura z para 150 - 300 μm para criar imagens de toda a morfologia dendrítica (Figure 2D e 2E). Use varredura lenta e média para obter imagens nítidas mostrando a morfologia neuronal (geralmente leva > 20 minutos para adquirir toda a morfologia dendrítica).
   NOTA: Os seguintes parâmetros são recomendados para imagens. Comprimento de onda de excitação: 1.000 nm, scanner: tipo galvanômetro, espelho dicróico: 690 nm, filtro de emissão: 575 - 620 nm passa-banda, detector: tipo GaAsP, ajuste de ganho > 100, tamanho da imagem > 512 x 512 μm, campo de visão > 600 x 600 μm, resolução de pixels < 1,2 μm.

Resultados

Figura 1: Cirurgia, preparo da janela craniana e fixação da barra de titânio. (A) Este painel mostra a remo...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
pK031. TRE-Cre	Autores	-	Disponível a partir de RIKEN BRC e Addgene
pK029. CAG-loxP-STOP-loxP-RFP-ires-tTA-WPRE	Autores	-	Disponível a partir de RIKEN BRC e Addgene
pK273. CAG-loxP-STOP-loxP-CyRFP-ires-tTA-WPRE	Autores	-	Disponível a partir de autores
Isoflurano	Wako	099-06571
410 Unidade de Anestesia (máquina de gás isoflurano)	Univentor	8323101
Vetbond (adesivo de tecido)	3M	084-1469SB
MμltiFlex Round (dica de carregamento)	Sorenson	13810
Gelfoam (esponja de gelatina)	Pfizer	09-0353-01
Agarose	Sigma	A9793	Baixo ponto de fusão
Round-shaped coverlam	Matsunami	-	Feito sob medida
Unifast 2 (cimento dentário)	GC	-
Titanium bar	Autores	-	Feito sob medida (veja a Figura 1G)
Rimadyl (carprofeno)	Zoetis	-	Injetável
2-photon microscope<	LSM7MP
Titânio-safira	Spertra-Physics	Mai-Tai eHPDS
Placa de titânio	Authors	-	Custom made (veja a Figura 2A)
IMARIS, FilamentTracer, MeasurementPro	BITPLANE
Goniometer stage	Thorlabs	GN2/M

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