Imagem de bioluminescência para estudar transientes de cálcio em estruturas cerebrais de Drosophila

Resumo

Fonte: Lark, A. R., et. al., Abordagem de imagem cerebral funcional in vivo baseada no indicador de cálcio bioluminescente GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra imagens em tempo real da dinâmica do cálcio usando Green bioluminescência de proteína fluorescente-aequorina em Drosophila estruturas cerebrais profundas.

Protocolo

1. Imaging

1. configuração
   1. Inicie o sistema de gravação ligando o microscópio, o computador, a câmera e o sistema de drenagem e configurando os controles ambientais da sala para 25 °C.
   2. Abra o programa Measurement and Automation Explorer no computador. Clique em "Devices and Interfaces", depois clique duas vezes em "NI Motion Devices" e, finalmente, clique com o botão direito do mouse em "PCI-7334" e selecione "initialize device".
   3. Abra o Photon Imager. Crie uma nova pasta e nomeie o primeiro arquivo de gravação. A câmera deve atingir -80 °C antes que o sistema funcione.
   4. Configure o sistema de perfusão: Adicione KCl (cloreto de potássio), nicotina e solução de Ringer aos reservatórios e ajuste para que cada solução seja descarregada a 2 ml/min. Lave com a solução de Ringer antes de iniciar o experimento.
2. Preparar sample
   1. Coloque o prato do bloco de montagem de imagem na montagem sob um microscópio com ampliação de 5X e insira o tubo de perfusão no canal através da punção.
   2. Defina o microscópio para o modo fluorescente, centralize e coloque os corpos dos cogumelos (MBs) em foco. Ajuste para 20X, centralize novamente e foque.
   3. Posicione o aparelho de drenagem sobre a piscina de drenagem, ajuste a altura do shunt de drenagem para que a ponta fique logo acima da piscina e execute a solução de Ringer por 30 segundos para garantir uma drenagem adequada.
   4. Puxe a blindagem para baixo para vedar o aparelho da luz. Usando o sistema automatizado no gerador de imagens de fótons, faça ajustes finos no foco e obtenha uma imagem fluorescente de referência dos MBs.
3. Gravação
   1. Ajuste a velocidade do fóton para a velocidade de gravação desejada (de 50 ms até 1 segundo ou mais). Selecione o modo de fótons e abra o obturador. Registre genótipo, sexo, idade e número da amostra em entradas de log. Ajuste a posição das caixas ROI (Região de interesse) sobre o cálice e os corpos celulares (CCB) e lobos mediais clicando nas caixas ROI e arrastando enquanto mantém o controle.
   2. Registre a linha de base por cerca de 5 a 10 minutos (conforme desejado).
   3. Aplique nicotina por 1 min. Observe iniciar/parar no log. Lave com solução de Ringer por 5 min.
   4. Aguarde 5 minutos para recuperação e prepare a entrada e o cronômetro de KCl (cloreto de potássio).
   5. Aplique KCl por 1 min. Observe iniciar/parar no log. Lave com solução de Ringer por 1 min.
   6. Mude para o modo fluorescente, tire a imagem fluorescente final e desligue a solução de Ringer.
   7. Pressione "Parar". Uma caixa de diálogo perguntará se você deseja desligar o sistema. Selecione "Não" para continuar a gravação.
   8. Abra a blindagem, mova o sistema de drenagem, mude a objetiva da lente para 5X e remova o tubo de perfusão. Remova o sample/prato de gravação do stage e limpe a lente 20X enxaguando e limpando a lente duas vezes com água.
   9. Pressione o botão branco de reprodução na parte superior da janela do programa para iniciar a próxima gravação.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sodium chloride	Sigma-Aldrich<
Calcium chloride	Merck	1023911000
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9
Cloreto de potássio	Prolabo	26 764.298
Cloreto de magnésio	Prolabo	25 108.295
Sucrose	Sigma-Aldrich<
Nicotine	Sigma-Aldrich	N3876
ATP	Sigma-Aldrich<	Adenosina 5′-trifosfato disodium salt hydrate
Benzyl-coelenterazine	Prolume, nanolight	Cat #301 Celulose h	http://www.prolume.com/<
Pontas de pipeta	Corning Incorporated	4868	100-1000μL Univesal Pipeta Tip
EM-CCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV	iXon (resfriado a -80°C)
Microscope	Nikon	N/A	Eclipse-E800
Immersion objective lens	Nikon	N/A	20x Fluor .5w
Microscópio de dissecação com fluorescência	Leica MZ Fl III	N/A	leica dissection scope and fluorscent lamp
Bomba peristáltica	Gilson	N/A	Minipuls 2
Tubing	Fisher Scientific	Depende da espessura	Tygon R3603, St-Gobain
Sistema de perfusão	Warner	64-0135 (VC-66CS)	Sistema de controle de válvula de perfusão, completo, com válvulas de aperto, 6 canais
Reguladores de perfusão	Leventon	201108	Dosi-flow 3
Measurement and automation explorer	Sciences Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Photon imager	Science Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Photon viewer	Science Wares & National Institutionments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel	Microsoft	N/A	software https://www.microsoft.com
Virtual dub	open access	N/A	software http://virtualdub.sourceforge.net/

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