Ablação neuronal direcionada usando microscopia de dois fótons em uma larava de peixe-zebra

Resumo

Source: <a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/57485/ ablação-neuronal-população-usando-dois-fótons-laser-sua-avaliação'>Muto, A., et al. Ablação de uma população neuronal usando um laser de dois fótons e sua avaliação usando imagens de cálcio e registro comportamental em larvas de peixe-zebra. J. Vis. exp. (2018)

Neste vídeo, é demonstrado um procedimento de ablação a laser de dois fótons, permitindo a destruição seletiva de neurônios fluorescentes em larvas de peixe-zebra imobilizadas com agarose. A imagem de alta resolução antes e depois do procedimento confirma o dano neuronal eficiente, observado pela ausência de fluorescência.

Protocolo

1. Ablação de uma subpopulação de neurônios usando um microscópio a laser de dois fótons <

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1. Comece configurando o acoplamento de uma linha Gal4 que rotula neurônios específicos a serem estudados e UAS:EGFP ou UAShspzGCaMP6s. Certifique-se de usar o plano de fundo nacre plano de fundo para ambos os pais para que nacre homozigotos possam ser obtidos.
   NOTA: Homozigotos de nacre não contêm melanóforos na superfície do corpo (Figura 1B). No presente estudo, são utilizadas uma linhagem Gal4 gSAIzGFFM119B (que marca o pretectum) e outra linha Gal4 hspGFFDMC76A (que marca o ILH (Lóbulo do hipotálamo).

2. No dia seguinte à configuração do acasalamento, colete os ovos de peixe-zebra e eleve-os ao estágio larval, ponto em que os neurônios de interesse expressarão repórteres fluorescentes.

3. Monte a larva do peixe-zebra em 2% de baixo ponto de fusão-agarose (Figura 1B).

1. Comece preparando a solução estoque de agarose a 2%: dissolva 2 g de pó de agarose de baixo ponto de fusão em 100 mL de água do sistema (i.e., a água usada para manter o peixe-zebra adulto em um sistema de circulação de água) ou água E3, levando a água ao ponto de ebulição em um micro-ondas e misturando vigorosamente.

   1. Leve ao micro-ondas o caldo de agarose de 2% de baixo ponto de fusão até ferver. Despeje 3,5-4,0 mL de agarose na tampa de uma placa de Petri de 6 cm. Espere até que a agarose esfrie para que fique quente ao toque antes de prosseguir.

   2. Em seguida, coloque uma única larva (não anestesiada nesta etapa) na agarose. Continue ajustando a posição e a orientação da larva para que fique em pé, usando uma agulha de dissecação (Figura 1C), até que a agarose solidifique para garantir o posicionamento adequado da larva.
      NOTA: A larva continuará a nadar enquanto a agarose se solidifica.

   3. Assim que a larva estiver posicionada, aguarde 5 min para que a agarose solidifique completamente.

   4. Despeje 5 mL de solução de tricaína (0,4% na concentração de trabalho 1x) sobre a agarose.
      NOTA: Para evitar movimentos das larvas durante a ablação a laser, as larvas devem ser mantidas anestesiadas durante todo o procedimento de ablação.

4. Ablate a larva usando a função de branqueamento em um sistema de microscopia a laser de dois fótons.

1. Coloque a larva embutida em agarose sob um microscópio de varredura a laser de dois fótons e inicie o sistema de microscopia.

2. Inicie o software de aquisição de imagem e clique no botão "On" na guia "Laser" para ligar o laser (Figura 1D). Aguarde até que o "Status" do laser mude de "Ocupado" para "Modo bloqueado".

3. Na guia "Canais", defina o comprimento de onda do laser em 880 nm (potência máxima: aproximadamente 2.300 mW) para ablação EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) ou em 800 nm (potência máxima: aproximadamente 2.600 mW) para ablação GCaMP.

4. Selecione a lente objetiva 20X movendo manualmente o revólver da lente. Clique na guia "Localizar", clique em "GFP" (Proteína Fluorescente Verde) para alterar as vias ópticas e visualize diretamente a fluorescência a olho nu.

5. Localize o cérebro larval do peixe-zebra no centro da visão; em seguida, clique na guia "Aquisição" para voltar à microscopia de dois fótons.

6. Como um registro da condição 'antes da ablação', tire uma imagem z-stack com a lente objetiva 20X em uma velocidade de varredura rápida (para evitar danos causados pelo calor). Posteriormente, compare as imagens tiradas antes e depois dos experimentos de ablação (Figura 2A). Para obter uma pilha z, clique em "Z-Stack" para selecionar a opção z-stack e expandir a guia. Defina o limite inferior (clique no botão "Definir primeiro") depois de focar na extremidade ventral do cérebro larval e defina o limite superior (clique no botão "Definir último") depois de focar na superfície dorsal do cérebro. Em seguida, clique no botão "Iniciar experimento" para executar a aquisição de imagem z-stack.

7. Selecione a lente objetiva 63X movendo manualmente o revólver da lente.

8. Clique na guia "Localizar" para alternar para a microscopia epifluorescente, localize as células a serem ablacionadas no centro da view pelo olho e, em seguida, clique na guia "Aquisição" para voltar à microscopia de varredura a laser.

5. Na guia "Modo de aquisição", defina o "Tamanho do quadro" em 256 x 256. Clique em "Ao vivo" e observe os neurônios de interesse.

6. Começando pelo lado mais dorsal, encontre um plano focal no qual as células a serem ablacionadas estejam em foco.

7. Marque uma pequena área circular com cerca de um terço do tamanho da célula em diâmetro em cada neurônio como uma região de interesse (ROI) usando a função "Regiões".

8. Defina a velocidade de digitalização para 13,93 s/256 x 256 pixels (134,42 μm x 134,42 μm), o que corresponde a um tempo de permanência do laser de aproximadamente 200 μs/pixel ou 200 μs/0,5 μm. Além disso, defina 4 repetições ('Ciclo de iteração: 4'). Como alternativa, otimize o número de iterações e a velocidade de varredura para que a ablação suficiente seja alcançada.

9. Execute a função 'Branqueamento' para ablação, em combinação com a 'Série temporal (2 ciclos)' para obter a imagem da amostra (antes e depois da ablação) e 'Regiões' (para definir os ROIs) ou funções equivalentes no software usado (Figura 1D).

10. Ao comparar a primeira imagem (antes da ablação) e a segunda imagem (após a ablação) no ciclo da série temporal, certifique-se de que, após o branqueamento, a fluorescência nas células-alvo diminua para a observada no nível de fundo (Figura 2B).

11. Se a fluorescência ainda estiver presente após a ablação, aumente o número de iterações.

12. Em seguida, mova o plano focal um pouco mais fundo (ou seja, em direção ao lado ventral) e escolha o próximo plano focal onde as células não abladas aparecem.

13. Execute a função de branqueamento. Repita essas etapas até que todas as células da estrutura neural de interesse tenham sido ablacionadas.

14. Depois de passar por todos os planos focais que cobrem as estruturas neurais a serem abladas, verifique se há fluorescência abolida nas células. Se algumas células ainda forem fluorescentes devido à ablação insuficiente, irradie-as novamente como descrito acima.

15. Se a larva precisar ser recuperada da agarose após a irradiação a laser, não tente forçá-la a sair da agarose, pois isso pode danificar a larva. Em vez disso, faça cuidadosamente pequenos cortes na agarose ao redor da larva perpendicularmente à superfície de seu corpo. Em seguida, espere que a larva nade para fora da agarose por conta própria quando o anestésico passar.

16. Prossiga para a próxima larva para ablação ou realize experimentos de controle usando outra população de neurônios que não estão envolvidos no comportamento sob investigação.
    NOTA: Aqui, como controle, os neurônios olfatórios do bulbo em UAS:EGFP; As larvas de gSAIzGFFM119B foram ablacionadas a laser usando o mesmo protocolo descrito acima (Figura 2A, à direita).

17. Aguarde várias horas ou 1 dia para recuperação antes de prosseguir para a imagem Ca ou registro comportamental. Durante esse tempo de recuperação, verifique a saúde das larvas (ou seja, natação espontânea normal, nenhum dano aparente por calor ao redor da área ablada, etc.) e remova as larvas que mostram quaisquer sinais de saúde precária.

Resultados

Materiais