Microscopia de dois fótons para imagens in vivo de microvasculatura cerebral de camundongos

Resumo

Source:<a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove. com/v/53582/quantificação-da-arquitetura-vascular-cerebral-usando-microscopia-de-dois-fótons-em-um-modelo-de-camundongo-de-neuroinflamação-induzida-por-HIV'> Nishimura, C. et al. Quantificação da Arquitetura Vascular Cerebral usando Microscopia de Dois Fótons em um Modelo de Camundongo de Neuroinflamação Induzida pelo HIV. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra a visualização in vivo de capilares corticais no cérebro de camundongos usando microscopia de dois fótons. Ele descreve as etapas para injetar um corante fluorescente em um camundongo anestesiado com uma janela cortical de crânio fino, preparando a configuração para imagens e adquirindo imagens detalhadas de estruturas microvasculares cerebrais para análise.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Injeção do corante fluorescente

1. Aperte a pele de um camundongo anestesiado na coxa esquerda medial usando a pinça #5. Puxe suavemente a pele para cima e use uma tesoura para cortar e remover a pele. Prepare o corante de rodamina emissor de vermelho conjugado com dextrano (70 kDa) (10 mg / kg dissolvido em solução salina).
2. Localize a veia femoral. Utilizando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 30 G, aspirar uma solução previamente preparada de um corante fluorescente adequado para a imagem até à linha de 130 μl da seringa. Remova todas as bolhas de ar puxando o corante completamente para dentro da seringa e sacudindo firmemente a parede da seringa.
   1. Dobre a agulha de 30 G em um ângulo de aproximadamente 30 graus, pressionando-a contra uma superfície dura com o lado chanfrado para cima. Encha a agulha com o corante e descarte o excesso de líquido, deixando uma amostra de 100 μl.
3. Injete a amostra de 100 μl de corante lentamente na veia femoral. Depois de remover a agulha, aplique uma pressão constante e suave no local da injeção para parar qualquer sangramento. Deixe o corante circular por 5 min.
4. Feche a coxa esquerda costurando a pele com uma sutura 4-0 e, em seguida, vire cuidadosamente o mouse de bruços e coloque-o no arnês da placa de cabeceira do mouse.
   

2. In vivo} Imagem de dois fótons

1. Mova o aparelho cirúrgico para o microscópio de dois fótons, certificando-se de manter níveis contínuos de anestesia. Coloque uma pequena quantidade de solução salina a 0,9% no reservatório da placa de cabeça e abaixe a objetiva do microscópio para que ela entre em contato com a solução salina. Localize a área de interesse usando a objetiva de visualização de campo claro.
2. Defina a excitação do laser de dois fótons para um comprimento de onda apropriado para o corante fluorescente. Comece a imagem de dois fótons usando a objetiva de 25x.
   Observe que, nesses experimentos, usamos um dextrano conjugado a um corante de rodamina emissor de vermelho que foi excitado em um comprimento de onda de 780 nm. Um filtro de emissão passa-banda 607/36 foi usado para detectar a fluorescência do corante, e um filtro de emissão passa-banda 480/20 foi usado para detectar a autofluorescência arterial.
3. Localize um leito capilar na tela de visualização e amplie essa área usando o zoom óptico 2. Adquira imagens dos capilares usando o software de imagem de dois fótons.

Materiais