Imagem de fluorescência ao longo da vida da agregação de proteínas PolyQ em neurônios de Caenorhabditis elegans

Resumo

Fonte: Pigazzini, M. L., et. al. Caracterização de estruturas amilóides no envelhecimento C. Elegans Usando imagens de fluorescência ao longo da vida. J. Vis. exp. (2020).

Este vídeo demonstra o uso da microscopia de imagem de fluorescência (FLIM) para avaliar a agregação de proteínas poliQ em C. elegans}, comparando vermes deficientes em proteínas controle e chaperonas. O aumento da agregação em vermes deficientes em chaperonas promove a transferência de energia entre fluoróforos agrupados, reduzindo o tempo de vida da fluorescência. Mapas codificados por cores gerados pelo FLIM retratam essas diferenças, destacando os níveis de agregação entre os grupos experimentais.

Protocolo

1. Aquisição de dados FLIM

NOTA: Neste protocolo, o tempo de vida do fluoróforo é adquirido por meio do método TCSPC no domínio do tempo. O FLIM requer que um pulso de luz seja gerado pelo laser a uma taxa de repetição definida e constante. A taxa de repetição varia de acordo com o tipo de laser e precisa ser conhecida pelo usuário. As medições de vida útil são obtidas por detectores e equipamentos eletrônicos instalados ao lado de um microscópio convencional. Neste protocolo, as medições são realizadas em três microscópios confocais de varredura a laser diferentes com detectores e software fornecidos por duas empresas diferentes (Tabela de Materiais) para aquisição de tempos de vida de mRFP, CFP e YFP, respectivamente. Verifique se os filtros corretos de emissão/excitação estão no lugar e minimize qualquer luz de fundo ou luz de fundo do monitor antes de iniciar. Antes de iniciar qualquer experimento, estabeleça a fotoestabilidade do fluoróforo escolhido. Se o fluoróforo branquear em um curto espaço de tempo dentro dos tecidos do nematóide, não é adequado para medições FLIM em C. elegans.

1. Abra o software de aquisição FLIM. O software FLIM também permite o controle do microscópio confocal. Localize a guia/botão para permitir que as saídas do detector sejam habilitadas e pressione Habilitar saídas.
2. Adquira a função de resposta do instrumento (IRF), que descreve a precisão de tempo da configuração instrumental.
   NOTA: Esta etapa deve ser executada preferencialmente antes da montagem dos nematóides.
   1. Se disponível, remova os filtros de excitação/emissão.
   2. Coloque uma lamínula vazia acima da objetiva e encontre sua superfície. Registre o sinal de dispersão obtido da lamínula por um mínimo de 30 s.
      {TAG_70}}NOTA: Para tempos de vida de vários nanossegundos, o software de aquisição pode estimar automaticamente o deslocamento do IRF. Adquirir um IRF é sempre recomendado.
3. Coloque o slide com o C. elegans montado no palco. Usando uma lente de ampliação de 10x no modo de transmissão e localize a posição dos nematóides na lâmina.
4. Remova o slide, mude a objetiva para uma lente de ampliação de 63x e aplique o meio de imersão necessário (por exemplo, óleo). Recoloque a lâmina no palco e localize os nematóides.
5. Localize o Gerenciador de orifícios no software de aquisição e abra-o no Maximum. Comece a escanear a amostra, selecione uma região de interesse (por exemplo, cabeça, parte superior do corpo) e concentre-se em seu plano de projeção máximo.
6. Monitore a taxa de pulso do laser e os outros três valores presentes na interface do software: O Discriminador de Fração Constante (CFD), o TAG_129{}}{TAG_131}} (TAC) e o Conversor Analógico-Digital (ADC).
   NOTA: O laser deve ter uma porta máxima de 1 x 10⁸ contagens de fótons únicos. Este número representa o número máximo de fótons fornecidos pelo laser. O CFD fornece informações sobre o recebimento do pulso de fóton único em referência ao pulso de laser pelo detector. Esse valor deve ser aproximadamente 1 x 10⁵. O TAC discrimina entre o momento em que um fóton foi detectado e o próximo pulso de laser. Finalmente, o ADC converte a tensão TAC em um sinal de memória armazenável. O CFD, TAC e ADC devem ter valores semelhantes para garantir que os fótons emitidos pelo fluoróforo não sejam perdidos. A avaliação correta desses parâmetros garante que fótons suficientes sejam coletados para criar um mapa de vida útil preciso.
7. Na interface do software FLIM, visualize o número de fótons detectados: o valor do ADC deve estar entre 1 x 10⁴ e 1 x 10⁵. Se necessário, mude o foco para um plano diferente ou aumente a potência do laser para coletar mais fótons.
   NOTA: Em geral, o número de fótons gravados por segundo não deve exceder 1% da taxa de repetição do laser.
8. Na barra de menus, selecione a guia para definir os parâmetros de aquisição. Selecione scan sync in para permitir a detecção de um único fóton.
9. Defina a aquisição para um período fixo de tempo ou um número fixo de fótons. Por exemplo, adquira uma curva de decaimento de tempo de vida por 2 minutos ou até que um único pixel atinja uma contagem de fótons de 2.000 eventos únicos. Pressione Start para iniciar a aquisição.
   NOTA: Fluoróforos diferentes exigirão lasers e filtros de excitação e emissão diferentes. De acordo com o brilho da amostra, a potência do laser também pode ser ajustada, o que não interferirá na vida útil. Esses protocolos usam as seguintes configurações de excitação/emissão: YFP ex500/em520-50 nm, mRFP ex561/em580-620 nm. Um laser pulsado de dois fótons foi empregado para medições de CFP usando ex800 / em440 nm. A quantidade de tempo e contagem de fótons necessária para a aquisição de um mapa FLIM precisará ser estabelecida empiricamente para cada configuração e cada propósito experimental.

2. Análise de dados FLIM usando o software FLIMfit

NOTA: Realize a análise de dados usando a ferramenta de software FLIMfit desenvolvida no Imperial College London (consulte Figura 1).

1. Abra o software e importe arquivos de dados FLIM via Arquivo | Carregue os dados FLIM. Carregue todas as amostras de uma condição, mesmo que obtidas em sessões diferentes e de diferentes repetições biológicas.
2. Se necessário, segmente um único nematóide de qualquer imagem FLIM via Segmentação | Gerenciador de segmentação. Arraste a ferramenta de corte ao redor da área de interesse até que ela seja realçada. Depois de concluído, pressione OK.
   NOTA: A segmentação deve ser feita para todas as imagens.
3. Selecione uma pequena região onde a imagem baseada em intensidade de um C. elegans aparece (Figura 1, Setas 1). A curva de decaimento dessa região aparecerá na grande janela de decaimento no lado direito da interface (Figura 1{TAG_307}}, Seta 2).
   NOTA: O decaimento pode ser exibido linearmente ou logaritmicamente.
4. Defina os parâmetros corretos para extrapolar o tempo de vida por meio do algoritmo do software, conforme descrito nas etapas 2.5 a 2.8.
5. Na guia Data ({TAG_336}}Figura 1, Seta 3):
   1. Defina um valor } Mínimo Integrado} arbitrário bom ajuste. Dependendo da amostra C. elegans, esse valor varia de 40 a 300. Insira valores diferentes até que uma visualização satisfatória seja alcançada.
   2. Selecione um número Time Min e um número Time Max para limitar o sinal FLIM a esses valores. Todos os eventos que aparecem antes e depois desse limite serão excluídos.
      NOTA: Por exemplo, para a análise de mRFP, os eventos anteriores a 800 ps e posteriores a 4.000 ps foram excluídos. Esses valores dependem da vida útil do fluoróforo e precisam ser determinados pelo usuário final.
   3. Não altere a predefinição Counts/Photon de 1.
   4. Insira a taxa de repetição Taxa de repetição, em MHz, do laser utilizado durante a aquisição.
      NOTA: Para o protocolo atual, diferentes lasers foram utilizados com várias taxas de repetição. O laser de dois fótons usado para aquisição de tempos de vida CFP possui uma taxa de repetição de 80 MHz, para YFP o laser se repete a 40 MHz e para mRFP o valor é de 78,01 MHz. Esses valores foram inseridos no FLIMfit de acordo com a amostra analisada.
   5. Insira um valor Gate Max para excluir todos os pixels saturados.
      NOTA: Para medições de tempo de vida em C. elegans, esse valor é definido como qualquer número grande (por exemplo, 1 x 10⁸).
6. Na guia Lifetime, selecione um ajuste global a ser usado (por exemplo, um ajuste em pixels). Veja Figura 1, Seta 4.
   NOTA: Um ajuste } em pixels produzirá um decaimento ajustado a cada pixel individual. Um ajuste Em termos de imagem produzirá um ajuste global de cada imagem individual e exibirá um único valor de tempo de vida por imagem. Um ajuste Global produzirá um único ajuste em todo o conjunto de dados. Um único valor de tempo de vida é fornecido para todas as imagens.
7. Não altere nenhum outro parâmetro, exceto o No. Seleção de Exp se for sabido que o decaimento de fluorescência escolhido é multiexponencial e exibe mais de um único tempo de vida.
   NOTA: No presente protocolo, esta função foi utilizada para calcular o tempo de vida do fluoróforo CFP biexponencial.
8. Carregue o IRF através do menu IRF: IRF | Carregue IRF. Para estimar o deslocamento do IRF, selecione IRF | Estime o deslocamento da IRF. Um conjunto de valores aparecerá automaticamente na guia IRF. Uma vez estabelecido, não altere nenhum outro parâmetro desta guia.
9. Depois que todos os parâmetros estiverem definidos, pressione Ajustar conjunto de dados} (Figura 1, Seta 5). O algoritmo produzirá um ajuste para a curva de decaimento e estabelecerá um valor de tempo de vida para cada imagem.
   NOTA: O ajuste resultante, realçado em uma linha azul, deve se sobrepor a todos os eventos. Um bom ajuste é obtido quando todos os eventos são alinhados ao longo do ajuste.
10. Clique na guia Parâmetros (Figura 1, Seta 6), localizada nos menus superiores direitos da interface do software, e selecione Estatística: w_mean (média ponderada) e verifique se o chi2{{ TAG_598}} valor é o mais próximo possível de 1.
    NOTA: Um chi2 próximo a um garante a precisão do ajuste. O valor do tempo de vida da imagem selecionada é, portanto, revelado como tau_1.
11. Exporte qualquer informação de interesse: Arquivo | Exportar imagens de intensidade/tabela de resultados de ajuste/imagens/histogramas. Salve as configurações de dados usadas para calcular o tempo de vida: Arquivo | Configurações de dados salvos.
    NOTA: Os parâmetros empregados serão salvos para análise futura das amostras selecionadas.

3. Representações gráficas de dados FLIM

NOTA: Os tempos de vida coletados de diferentes amostras podem ser representados visualmente de várias maneiras. Selecione para indicar os valores de tempo de vida em nanossegundos ou picossegundos.

1. Mostre a qualidade do ajuste e a precisão da curva exportando a curva de decaimento diretamente do FLIMfit.
2. Represente a distribuição dos fótons plotando a frequência da contagem de fótons versus o valor do tempo de vida em um histograma.
3. Finalmente, para comparação estatística, se comparar duas ou mais amostras, coloque os valores do tempo de vida mais o desvio padrão da média em um gráfico de barras do gráfico de dispersão. Execute qualquer análise estatística desejada.

Resultados

Materiais