Visualização de um trombo cerebral em um camundongo usando imagens de microtomografia computadorizada

Resumo

Fonte: Kim, D., et. al. Imagem fluorescente combinada de infravermelho próximo e microtomografia computadorizada para visualização direta de tromboêmbolos cerebrais. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a visualização de trombos cerebrais em camundongos usando imagens de microtomografia computadorizada (micro-CT). Um modelo de camundongo tromboso cerebral é injetado com nanopartículas de ouro direcionadas à fibrina que atuam como um agente contrastante. O mouse é colocado na cama de uma máquina de micro-CT e as imagens são adquiridas de vários ângulos. Usando o software apropriado, as imagens são reconstruídas e processadas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação de coágulo formado exogenamente marcado com marcador de fluorescência (Figura 1)

1. Anestesiar um camundongo em uma câmara de indução usando isoflurano a 3% misturado com 30% de oxigênio (1,5 L/min 100% de oxigênio). Garanta a profundidade adequada da anestesia observando o tônus muscular e confirmando a ausência do reflexo de pinça do dedo do pé.
2. Coloque o animal em uma cortina estéril em decúbito ventral e mantenha-o sob anestesia usando uma máscara de inalação e isoflurano a 2% misturado com oxigênio a 30%. Execute os seguintes procedimentos usando técnicas assépticas e aventais/máscaras/luvas/instrumentos estéreis. Manter as condições estéreis limpando e higienizando a área experimental com álcool 70% antes e após os procedimentos.
3. Colete cerca de 300 ~ 1.000 μl de sangue arterial após a punção cardíaca. Misture 70 μl de sangue total com 30 μl de sonda C15 (concentração de 20 μmol/L), uma sonda fluorescente Cy5.5 sensível à atividade de reticulação de fibrina da enzima de coagulação do fator XIII ativado (FXIIIa), para marcar fluorescentemente o coágulo (Figura 1A). Injete o sangue misturado usando uma seringa de 3 ml (agulha de calibre 23) em um tubo de polietileno de 20 cm de comprimento (PE-50, ID 0,58 mm). Os tubos de PE devem ser esterilizados (ou certificados estéreis pelo fabricante) e os coágulos devem ser preparados assepticamente em uma capa de cultura de tecidos.
4. Verifique a morte do animal observando a falta de respiração e pulso cardíaco.
5. Deixe o tubo carregado de sangue à temperatura ambiente por 2 horas, depois a 4 ° C por 22 horas e execute os seguintes procedimentos, conforme relatado anteriormente.
6. Corte o tubo contendo trombo em pedaços de 1,5 cm de comprimento. Usando uma seringa de 3 ml cheia de solução salina tamponada com fosfato (PBS), expulse o trombo para uma placa de 6 poços contendo PBS injetando suavemente PBS em cada pedaço de tubo. Lave os trombos três vezes com PBS (Figura 1B).
7. Carregue a porção final distal de um tubo PE-10 de 15 cm de comprimento (ID 0,28 mm) com um trombo de 1,5 cm de comprimento, puxando cuidadosamente o trombo lavado, evitando bolhas de ar, usando uma seringa de 1 ml cheia de solução salina com uma agulha de calibre 30 que é inserida na extremidade proximal do tubo.
8. Conecte o tubo PE-10 carregado com trombo com um tubo PE-3 de 50 cm de comprimento (ID 0,58 mm) modificado para ter uma extremidade cônica (ID 200 μm), que será colocado na área de bifurcação da artéria cerebral média (MCA) – artéria cerebral anterior (ACA) da artéria carótida interna (ICA) em um modelo de camundongo de AVC embólico (Figura 1C).

2. Modelando um modelo de camundongo de AVC tromboembólico (Figura 2)

1. Anestesiar um camundongo diferente para ser acariciado em uma câmara de indução usando isoflurano a 3% misturado com oxigênio a 30% (1,5 L/min). Injete meloxicam (5 mg/kg) por via subcutânea para aliviar a dor pós-cirúrgica. Garanta a profundidade adequada da anestesia observando o tônus muscular e confirmando a ausência do reflexo de pinça do dedo do pé.
2. Aplique uma pequena quantidade de pomada veterinária em cada olho para evitar o ressecamento durante a anestesia. Realize os seguintes procedimentos cirúrgicos usando técnicas assépticas e aventais/máscaras/luvas/instrumentos estéreis. Mantenha as condições estéreis limpando e higienizando a área cirúrgica com álcool 70% antes, durante e após a cirurgia.
3. Mova o mouse para uma mesa de operação. Coloque o animal em um campo estéril em decúbito ventral e mantenha-o sob anestesia usando uma máscara inalatória e isoflurano a 2%. Em seguida, aperte a temperatura corporal em 36,5 °C usando um cobertor homeotérmico com feedback de um termômetro retal.
4. Após a preparação cirúrgica com betadina e álcool a 70%, faça uma incisão vertical de 1 cm usando um bisturi no couro cabeludo entre a orelha esquerda e o olho. Cole a extremidade distal da fibra óptica de um fluxômetro Doppler a laser na superfície exposta do osso temporal esquerdo (1 mm à esquerda e 4 mm abaixo do bregma). Em seguida, inicie o monitoramento do fluxo Doppler (Figura 2A).
5. Deite o animal. Endireite o pescoço puxando o dente frontal superior com uma corda presa a um alfinete e raspe a área do pescoço. Em seguida, faça uma incisão vertical na linha média de 3 cm, abra-a e exponha a área do bulbo carotídeo esquerdo dissecando os tecidos moles perivasculares. Tenha cuidado para não ferir o nervo vago.
6. Ligue a artéria carótida comum proximal esquerda (ACC) usando uma sutura estéril de seda preta 6-0 e ligue a ACI esquerda e a artéria pterigopalatina esquerda (PPA) usando suturas estéreis de seda preta 7-0.
7. Cauterize a artéria tireóidea superior esquerda, que é um ramo da artéria carótida externa esquerda, usando um cautério elétrico monopolar, e ligue a artéria carótida externa proximal esquerda (ECA) frouxamente e o local mais distal firmemente usando suturas estéreis de seda preta 7-0.
8. Usando uma microtesoura, faça um pequeno orifício (cerca de 0,2 ~ 0,25 μm de diâmetro) entre os locais ligados do ECA.
9. Insira o cateter contendo trombo no orifício da ECA enquanto afrouxa a ligadura proximal da ECA. Aperte a ligadura proximal da ECA novamente depois de avançar o cateter para dentro da CCA para prender o cateter no lugar.
10. Cauterize para cortar a parte distal da ACE, que é distal ao local da ligadura distal, e gire a ACE proximal livre no sentido horário para alinhá-la à direção da ACI enquanto retira o cateter da ACC. Em seguida, avance o cateter cerca de 9 mm na área de bifurcação MCA-ACA da ACI distal imediatamente após afrouxar a ligadura da ACI. Em seguida, aperte a ligadura ICA.
11. Coloque o trombo na área de bifurcação pressionando suavemente a seringa 1 ml para injetar o trombo. Verifique a diminuição do fluxo sanguíneo cerebral (FSC) com Doppler, que deve ser reduzido em 30% ou menos em comparação com a linha de base, se o trombo ocluiu o vaso com sucesso (Figura 2B).
12. Remova o cateter e ligue o local proximal da ECA imediatamente e firmemente. Além disso, retire o CCA e o PPA.
13. Feche o local da incisão usando suturas de seda 6-0. Interrompa a anestesia após continuar o monitoramento com Doppler por um período de tempo necessário (aqui, por 30 minutos após a injeção de trombo). Retorne o mouse em uma gaiola vazia e mantenha-o aquecido com uma lâmpada de aquecimento. Não deixe o rato sem vigilância até que ele tenha ganhado consciência suficiente para manter a decúbito esternal.

3. In vivo Imagem MicroCT de trombo cerebral (Figura 3)

1. Re-anestesiar o camundongo com isoflurano a 2% conforme descrito na etapa 2.1 em um ponto de tempo pré-especificado (aqui, 1 hora) após o início do acidente vascular cerebral embólico devido à colocação do trombo na artéria cerebral. Garanta a profundidade adequada da anestesia, confirmando a ausência do reflexo de pinça do dedo do pé. Aplique uma pequena quantidade de pomada veterinária em cada olho para evitar o ressecamento durante a anestesia.
2. Ressuspenda nanopartículas de ouro direcionadas à fibrina (fib-GC-AuNP4) a uma concentração de 10 mg Au / ml em PBS 10 mM e sonice o agente de imagem do trombo por 30 min para garantir a dissolução e dispersão das nanopartículas. Injete 300 μl de fib-GC-AuNP (10 mg / ml) na veia peniana.
3. Coloque o animal na cama de uma máquina de microCT e endireite o pescoço puxando o dente frontal superior com uma corda presa a um pino para reduzir os artefatos de movimento.
4. Aos 5 minutos após a injeção de fib-GC-AuNP, comece a obter imagens de micro-TC do cérebro. Para os experimentos descritos aqui, use os seguintes parâmetros de imagem: 65 kVp, 60 μA, 26,7 x 26,7 x 27,9 mm³ campo de visão, 0,053 x 0,053 x 0,054 mm³ tamanho do voxel, 100 milissegundos por quadro, uma média, 360 visualizações, matriz de reconstrução 512 x 512, 600 fatias, Tempo de varredura de 64 segundos.
5. Retorne o mouse para uma gaiola vazia e mantenha-o aquecido com uma lâmpada de aquecimento. Não deixe o rato sem vigilância até que ele tenha ganhado consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
6. Transforme os dados brutos da imagem no formato Digital Imaging and Communications in Medicine (DICOM) usando o comando 'Start' do painel 'Reconstruction' em um pacote de software instalado no scanner micro-CT.
7. Para análises quantitativas das imagens (na etapa 6), transforme os dados DICOM em formato TIFF usando um pacote de software disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
8. Para análises qualitativas, bem como análises quantitativas de forma mais simples e rápida, use o pacote de software e as imagens originais de 0,054 mm de espessura em formato DICOM para gerar um novo conjunto de imagens axiais e coronais renderizadas para ter 1 ou 2 mm (aqui, 2 mm) de espessura, como segue.
   1. Selecione a pasta DICOM na árvore 'Fonte de dados', clique com o botão direito do mouse e importe a pasta para 'MasterDB' ou 'PrivateDB.'
   2. Clique em 'MasterDB' ou 'PrivateDB' na árvore 'Fonte de dados' e selecione a pasta importada. Depois de clicar na guia '3D' no painel mais à esquerda, quando a janela 'Opções de carregamento' aparecer, pressione 'OK' para importar uma sequência de imagens na pasta como uma pilha.
   3. Altere a representação da imagem para o formato de projeção de intensidade máxima (MIP) clicando na palavra 'MRP' nas janelas de imagem axial e coronal e escolhendo 'MIP' no menu pop-up. Em seguida, altere a espessura da imagem para 2 mm depois de clicar em 'TH : 0 [mm]' na mesma janela.
   4. Usando a barra de navegação 3D de 2 mm de largura que permite explorar uma pilha de imagens e cortá-la em um ângulo e local apropriados, prepare uma imagem de seção axial de 2 mm de espessura com cobertura total do círculo de Willis (COW), que abriga trombos. Clique no botão de captura (ícone da câmera) no painel 'Saída'. Salve a imagem no formato TIFF.
9. Em seguida, prepare cinco imagens de corte coronal de 2 mm de espessura que cobrem contíguamente do lobo frontal ao cerebelo.
   1. Primeiro, prepare o segundo corte alinhando cuidadosamente a barra do navegador na imagem axial para que a imagem coronal possa visualizar melhor os trombos MCA-ACA.

Em seguida, prepare as outras quatro fatias de forma contígua. Clique no botão de captura (ícone da câmera) no painel 'Saída'. Salve as imagens no formato TIFF.

Resultados

Figura 1: Visão geral da preparação do coágulo sanguíneo marcado com fluorescência. (A) Mistura de sangue total fresco com sonda fluorescente de infravermelho próximo (NIRF) Cy5.5 (C15) que está covalentemente ligada às fitas de fibrina do t...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Machines
microCT	NanoFocusRay, JeonJu, Coreia	NFR Polaris-G90
	Perimed, Estocolmo, Suécia	5000
Microscópio cirúrgico	Leica Microsystems, Seul, Coréia	EZ4HD
	PerkinElmer, Massachusetts, EUA	XGI-8
Software
Controle NFR	NanoFocusRay, JeonJu, Coréia	NFR Polaris-G90	microCT software de controle
Lucion	Infinitt, Seul, Coréia	Lucion	3D render imaging software
Gráfico de laboratório 7	ADInstruments, Colorado, EUA	Gráfico de laboratório 7	rCBF
Image J software	Wanye Rasband, NIH, EUA	Análise de imagem	1.49d
Dispositivos/Instrumentos
Bomba de infusão	Harvard, Massachusetts, EUA	bomba 22( 55-2226)
Manta homeotérmica	Panlab, Barcelona, Espanha	HB101
Cautério de bolso	Daejong, Seul, Coréia	DJE-39
Matriz cerebral	Ted pella, CA, EUA	15003	seção coronal
PE-50 tubulação	Natsume, Tóquio, Japão	SP-45 (PE-50)	ID 0,58 mm OD 0,96 mm
PE-10 tubulação	Natsume, Tóquio, Japão	SP-10(PE-10)	I.D. 0.28mm O.D. 0.61 mm
30 gauge	agulha sungshim-medical, Seul, Coreia
Seringa	CPL-medical, Ansan, Coreia		1 & 3 cc
Gaze	Panamedic, Cheonan, Coreia
Fita	Scotch, Seul, Coreia	3M-810
Micro fórceps	Fine Science Tools, Vancouver, Canadá	11253-27	Dumont #L5
Micro tesoura	Fine Science Tools, Vancouver, Canadá	15000-03	Vannas spring
Scissor	Fine Science Tools, Vancouver, Canadá	14084-08	de 8,5 cm
	Ailee, Busan, Coréia	SK6071, SK728	6-0 e 7-0
Reagentes
Meloxicam	Yuhan, Seul, Coreia
Pomada veterinária	Novartis, Basel, Swiss
10% Povidona-iodo (betadina)	Firson, Cheon-an, Coreia
Cloreto férrico	Sigma, Missouri, Estados Unidos	157740-5G
TTC	Amresco, Ohio, EUA	0765-100g
Isoflurano	Hana-Pham, Gyeonggi, Coréia	Ifran	100 mL
	PBS Welgene, Daegu, Coréia	LB001-02	500 mL
Síntese de nanopartículas
Solução salina normal	Daihan Pham, Seul, Coréia	48N3AF3	20 mL

Medidor de vazão Doppler a laser Máquina de anestesia por inalação Sutura de seda preta de ouro