Ultrassom não invasivo de alta frequência e imagem Doppler da hemodinâmica do cérebro de ratos

Resumo

Fonte: Giustetto, P., et. al., Ultrassom não invasivo parenquimatoso, vascular e metabólico de alta frequência e imagens cerebrais profundas de ratos fotoacústicos. J. Vis. Exp. (2015)

Neste vídeo, demonstramos o uso de ultrassom de alta frequência e imagens fotoacústicas para estudar a vasculatura e o conteúdo de hemoglobina no cérebro de ratos. Este método fornece informações detalhadas sobre a perfusão cerebral e a oxigenação do sangue, permitindo a análise não invasiva das estruturas vasculares cerebrais e da distribuição de oxigênio.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação

1. Anestesia
   1. Coloque o animal dentro da câmara de isoflurano apropriada para anestesiar
   2. Encha a câmara com uma mistura de O₂ e isoflurano para uso veterinário a uma concentração de 2,5% em uma câmara de gás de 2 L e aguarde cerca de 3 minutos para que o rato adormeça. Verifique o efeito da anestesia por uma pitada no dedo do pé.
   3. Assim que a anestesia fizer efeito, remova o rato e pese-o.
   4. Espalhe uma fina camada de gel oftálmico solúvel em água nos olhos do animal para protegê-los e manter a hidratação fisiológica ocular.
   5. Deite o rato em uma bancada de ultrassom e estação de imagem fotoacústica. Para manter o efeito anestésico, posicione rapidamente o nariz dentro da máscara apropriada, proporcionando um fluxo constante de anestesia (isoflurano 2%-2,5% em oxigênio 1 L/min).
2. Raspar o animal
   1. Espalhe uma camada consistente de creme depilatório na superfície da cabeça, com atenção para cobrir as áreas ao redor das orelhas e pescoço. Deixe o creme agir por alguns minutos e retire-o delicadamente com uma espátula. Remova suavemente todos os restos de creme com uma esponja úmida para limpar a pele com precisão.
      NOTA: O pelo do animal aprisiona o ar que afeta negativamente a aquisição de imagens baseadas em ultrassom, portanto, deve ser necessariamente removido o máximo possível.
3. Posicionando o animal
   1. Organize o animal em uma posição de águias abertas. Monitore os sinais vitais por meio de sensores de parâmetros vitais apropriados na bancada (se estiverem presentes). Apoie as patas nos sensores depois de aplicar algumas gotas de creme de eletrodo para uso profissional.
      NOTA: Durante a anestesia, certifique-se de que os parâmetros vitais tenham os seguintes valores: a temperatura corporal do rato ≈ 37,5 °C, os batimentos cardíacos por minuto (BPM) variam entre 250 e 350 e a frequência respiratória está compreendida na faixa de 40-80 respirações por minuto.
   2. Por fim, prenda os membros com adesivo de seda artificial hipoalergênico. Se necessário, espalhe novamente uma fina camada de gel oftálmico solúvel em água para proteger os olhos do animal.

2. Aquisição de Imagens do Ponto de Vista Temporal

1. Posicionamento do animal
   1. Mantendo o animal em decúbito ventral, gire seu corpo levemente para o lado, com um ângulo de inclinação de cerca de 45° em relação ao eixo do corpo sagital. Use pequenos rolos de gaze de algodão como suportes para organizar corretamente o descarte (Figura 1a).
   2. Levante a cabeça do animal e gire-a levemente para um lado (Figura 1a). Use um rolo de algodão como suporte, mantendo o focinho bem inserido na máscara de anestesia.
   3. Incline a bancada em um ângulo de cerca de 30° em relação ao plano horizontal.
   4. Gire o transdutor de imagem em um ângulo de cerca de 30° em relação ao plano vertical.
2. Aquisição de imagens anatômicas e vasculares ultrassônicas e fotoacústicas
   1. Ative a varredura de imagem, entre na aquisição de imagem do Modo B e defina corretamente todos os parâmetros de aquisição de imagem para respeitar os possíveis requisitos do experimento (Figura 2a).
      NOTA: Defina a frequência do centro de transmissão o mais baixa possível (16 MHz, Figura 2b), para ter a profundidade de penetração máxima possível para o transdutor.
   2. Descarte uma camada consistente (cerca de 1 cm de espessura) de gel de transmissão de ultrassom hipoalergênico solúvel em água na cabeça do animal (Figura 1b). Cubra a cabeça do transdutor com uma fina camada do mesmo gel e coloque-a em contato com a camada do rato. Use gel quente para minimizar a hipotermia localizada.
   3. Inicie a aquisição da imagem no Modo B e ajuste o posicionamento do transdutor em tempo real, identificando referências anatômicas e centralizando a região de interesse no ponto médio do monitor. Certifique-se de eliminar as bolhas de ar em qualquer nível presas na camada de gel, pois elas afetam negativamente a aquisição.
   4. Coloque o transdutor para alinhá-lo ao eixo virtual que conecta o ouvido ao olho (Figura 3a) para obter uma focalização ideal do feixe. Adquira diferentes visões do volume interno do cérebro, por rotação no sentido horário ou anti-horário (Figura 3b e c).
   5. Eventualmente, prenda o transdutor em um suporte mecânico para proteger a posição de forma estável e ajustar a orientação de maneira fina.
   6. Certifique-se de que a região cerebral de interesse esteja localizada a 10 mm de profundidade em relação à fonte do transdutor US-LASER para receber um sinal de resposta fotoacústica ideal (Figura 4). Em seguida, coloque o indicador da focalização da onda US exatamente no centro da área analisada.
      NOTA: Durante a pesquisa de áreas de interesse, evite a ativação da opção de porta de respiração, a fim de acelerar o procedimento de posicionamento.
   7. Entre no modo Doppler colorido para visualizar os vasos sanguíneos internos do cérebro de maneira altamente sensível.
   8. Uma vez que o posicionamento tenha sido definido de forma apropriada para visualizar as regiões desejadas, ative a opção de porta de respiração para evitar efeitos indesejados relacionados ao movimento (Figura 5a).
   9. Escolha o parâmetro de aquisição desejado definido no Modo Doppler Colorido (Figura 5b) e adquira imagens nesta modalidade para distinguir velocidades e direções da corrente sanguínea, até vários milímetros de profundidade de penetração.

Resultados

Figura 1: Descarte de animais para aquisição de imagens temporais. (a) A disposição do animal na bancada para aquisição de imagens: após a depilação da cabeça, o animal é colocado em decúbito ventral com o corpo ligeiramente inclinado para um lado ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Estação de ultrassom e imagem fotoacústica de alta frequência (sistema VEVO LAZR 2100)	FUJIFILM VisualSonics Inc.
Sistema compacto de anestesia dupla Vevo (versão de mesa)	FUJIFILM VisualSonics Inc.		http://www.visualsonics.com/anesthesiasystem#sthash.opODtSht.dpuf
Gel de transmissão de ultrassom (Aquasonic 100)	PARKER LABORATORIES INC.	01-08	http://www.parkerlabs.com/aquasonic-100.asp
Ratos Sprague-Dawley	Charles River Laboratories		Três ratos Sprague-Dawley de 6 semanas de idade foram comprados pelos Charles River Laboratories e mantidos em alojamento padrão (ciclos claro-escuro de 12 h) com uma ração padrão para roedores e água disponível ad libitum. Fornecido por: http://www.criver.com/