Microscopia de dois fótons para monitorar a dinâmica do cálcio em fotorreceptores de cone de retina de camundongos

Resumo

Fonte: Kulkarni, M. et al. Dinâmica de Ca²⁺ em terminais axônicos fotorreceptores de cone da retina de camundongos. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra o uso de microscopia de dois fótons para monitorar a dinâmica do cálcio em fotorreceptores de cone de uma retina de camundongo transgênico. Ele descreve as etapas para preparar fatias de retina, imagens de biossensores de cálcio baseados em FRET e analisar alterações de fluorescência para quantificar os níveis de cálcio sob iluminação de fundo e estimulação de luz.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Preparação de fatias (10 - 15 min)
   1. Prepare previamente membranas de filtro de nitrocelulose para fatiamento de retina e lamínulas de vidro para montar fatias e transferi-las para a câmara de gravação. Corte a membrana do filtro de nitrocelulose em pedaços retangulares de aproximadamente 10 x 5 mm usando uma tesoura. Corte as lamínulas em pedaços retangulares de aproximadamente 10 x 5 mm usando um cortador de vidro.
   2. Mergulhe lentamente uma lâmina de vidro na solução extracelular próxima ao tecido. Delicadamente, puxe a fatia de retina obtida do camundongo biossensor HR2.1:TN-XL Ca²⁺ para a lâmina de vidro com a célula ganglionar voltada para cima, agarrando-a pela borda usando uma pinça. Este processo reduz os danos mecânicos e o dobramento do tecido.
   3. Escolha a região da retina que está relacionada à respectiva questão de pesquisa. Corte um pedaço retangular de aproximadamente 1 x 2 mm da região retiniana selecionada usando uma lâmina de bisturi curva. Limpe o excesso de solução ao redor do tecido.
   4. Coloque a membrana do filtro no topo do pedaço de retina de forma que o lado da célula ganglionar adira à membrana. Imediatamente, adicione uma gota de meio extracelular na membrana para prender firmemente o tecido à membrana.
   5. Transfira o tecido retiniano montado na membrana para a câmara de corte contendo solução extracelular fresca.
   6. Corte a retina em fatias verticais de 200 μm de espessura (Figura 1B) usando uma lâmina de barbear nova presa a um picador de tecido. Troque a lâmina para cada peça da retina.
      Nota: A lâmina de barbear precisa estar perfeitamente alinhada com a superfície do fundo da câmara de corte, de modo que toda a membrana se divida simultaneamente, conforme indicado por um som de "clique" ao cortar. Caso contrário, a lâmina pode dobrar e danificar a fatia.
   7. Cole uma única fatia montada em membrana em uma lamínula de vidro aplicando graxa de alto vácuo apenas nas extremidades da membrana (Figura 1C). Mantenha a superfície de vidro abaixo da retina livre de graxa.
   8. Mantenha as fatias montadas em lamínula cobertas por uma gota de solução extracelular na câmara de retenção - um recipiente fechado e à prova de luz, por exemplo, uma placa de Petri com a tampa coberta com folha de alumínio - sob uma atmosfera de carboxigênio à temperatura ambiente (RT). Introduzir carboxigénio borbulhando um pequeno reservatório de água para manter a atmosfera na câmara de retenção humidificada; Isso evita que as fatias sequem.
   9. Deixe as fatias descansarem na câmara de retenção por 10 a 15 minutos antes de movê-las (uma a uma) para a câmara de registro. As fatias podem ser mantidas por até 4-5 horas em uma câmara de retenção em RT (~ 21 °C).

2. Imagem de dois fótons Ca²⁺

1. Microscopia de dois fótons
   1. Use um microscópio de dois fótons do tipo Microscópio Objetivo Móvel (MOM).
      Nota: Qualquer microscópio vertical de dois fótons que atenda aos seguintes requisitos mínimos pode ser usado: Deve ser equipado com (a) um laser pulsado sintonizável para ~860 nm, (b) um mínimo de dois canais de fluorescência adquiridos simultaneamente, (c) filtros para proteína fluorescente ciano aprimorada (eCFP) e fluorescência citrina, (d) um estimulador de luz e (e) software que permite registrar sequências de imagens com lapso de tempo a uma taxa de quadros suficiente para resolver os sinais de Ca²⁺ de interesse.
   2. Inicie o sistema de imagem de dois fótons conforme indicado pelo fabricante. Siga rigorosamente as diretrizes de segurança a laser da instalação. Inicie o laser e ajuste-o para ~ 860 nm.
   3. Transfira uma fatia da câmara de retenção para a câmara de registro e comece imediatamente a perfundir com solução extracelular carboxigenada. Manter um caudal de perfusão de 2 ml/min e uma temperatura de 37 °C na câmara de registo.
   4. Use uma objetiva de imersão em água de abertura numérica (NA) de 20X 0,95. Se disponível, use uma câmera de dispositivo de carga acoplada (CCD) em combinação com um diodo emissor de luz infravermelha (LED) abaixo da câmara de gravação para localizar o corte de retina (Figura 2). Caso contrário, localize a fatia usando imagens de dois fótons (consulte 2.1.5).
   5. Mude para imagens de dois fótons para visualizar a expressão do biossensor. Ligue os dois canais de detecção para imagens de fluorescência de eCFP e citrino.
   6. Use o software de aquisição de imagem que controla o microscópio de dois fótons para escanear e selecionar uma linha de terminais de cone para gravação (Figura 3A). Defina a aquisição de imagem para imagens de 128 x 16 pixels (31,25 Hz) ou uma configuração semelhante. Restrinja a área digitalizada aos terminais cônicos para evitar o branqueamento de fotopigmentos nos segmentos externos.
      Nota: Para o sensor de cálcio TN-XL (τ = ~0,6 s para ligação de Ca²⁺, τ = ~0,2 s para desvinculação de Ca²⁺), recomenda-se uma taxa de quadros mínima de ~8 Hz.
   7. Estimulação e gravação de luz
      1. Use um estimulador de luz de campo completo de subestágio para executar as seguintes etapas.
         Nota: Uma solução simples para um estimulador de luz de campo completo é usar dois LEDs filtrados por passagem de banda (por exemplo, "azul": 360 passa-banda (BP) 12, "verde": 578 BP 10) que correspondem às sensibilidades de comprimento de onda dos cones de mouse, mas ao mesmo tempo não se sobrepõem aos filtros usados para detecção de fluorescência. A luz dos LEDs é focalizada pelo condensador através da parte inferior da câmara de gravação (Figura 2).
      2. Ligue o laser e permita que os cones se adaptem ao laser de varredura e à luz de fundo do estímulo (20 - 30 segundos) antes de apresentar estímulos luminosos (ver 2.2.3) ou aplicar agentes farmacológicos.
      3. Inicie a apresentação de estímulos arbitrários (por exemplo, flashes de luz, como mostrado na Figura 3B, C). No caso do estimulador descrito na etapa 2.2.1, gere os estímulos modulando a intensidade dos dois LEDs ao longo do tempo usando uma placa microprocessada controlada por software personalizado.
      4. Comece a gravar os dois canais de fluorescência (por exemplo, a 483 nm para "azul"
   8. ECFP do doador de transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) e a 535 nm para o aceptor FRET "amarelo") simultaneamente usando o respectivo software de aquisição de imagem (ver também 2.1.6). Por exemplo, no caso de flashes de luz (Figura 3B, C), registre pelo menos 8 a 10 apresentações de estímulos (tentativas).

Resultados

Figura 1. Preparação de cortes verticais da retina. (UMA) Retina isolada e achatada preparada para fatiar. (B) Pedaço retangular de retina (veja a caixa vermelha em A) montado na membrana de papel de filtro (cinza escuro) após...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Graxa de alto vácuo	Dow Corning	1018817	http://www.dowcorning.com
Lamínulas	R. Langenbrinck		24 x 60 mm; http://www.langenbrinck.com
Corrediças de vidro	R. Langenbrinck		76 x 26 mm; http://www.langenbrinck.com
Lâminas para picador de tecidos	MARTOR KG	ARGENTAX No. 1044	0,25 mm; http://www.martor.de
Cortador de tecidos	Membrana de
filtro de nitrocelulose personalizada grelhada	Merck Millipore	AABG01300	Tipo de filtro: 0,8 μm; http://www.emdmillipore.com
Estimulador de campo completo baseado em LED UV/verde	Placa
microprocessador de código aberto	Arduino		http://www.arduino.cc
Software de imagem CfNT	Escrito		Desenvolvido por Michael Müller, MPI para Pesquisa Médica, Heidelberg, Alemanha
IgorPro	Wavemetrics		http://www.wavemetrics.com
VC3-4 Sistema focal sistema de perfusão	ALA Scientific Instrument		Com coletor de ponta de 100 μm de diâmetro; http://www.alascience.com/
Mai Tai HP DeepSee (laser Ti:Sapphire)	Newport Spectra-Physics		http://www.spectra-physics.com
Microscópio objetivo móvel (MOM), projetado por W. Denk, MPImF, Heidelberg, Alemanha	Sutter Instruments		http://www.sutter.com/MICROSCOPES/index.html
XLUMPlanFL 20x/0.95w objetiva	Olympus		http://www.olympusamerica.com
Leica MZ95	Leica microsystems		http://www.leica-microsystems.com/

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