Imagem de células vivas da migração nuclear glial de Muller durante a regeneração da retina do peixe-zebra

Resumo

Fonte: Lahne, M., et.al. Cultura de explantes retinianos de peixe-zebra transgênicos adultos para imagens de células vivas por microscopia multifotônica. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra imagens de células vivas da migração nuclear glial de Muller em explantes retinianos de peixe-zebra embebidos em agarose após danos por fotorreceptores induzidos por luz. O fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) liberado por fotorreceptores danificados ativa as células gliais de Muller, desencadeando a migração nuclear através das camadas nucleares interna e externa para mitose e geração de progenitores neuronais. As imagens capturadas revelam a dinâmica da migração nuclear e a diferenciação do progenitor durante a regeneração da retina.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvam amostras de animais foram revistos e aprovados pelo comité de revisão ética animal adequado.

1. Microscopia Multifotônica

NOTA: Os experimentos realizados neste manuscrito foram otimizados para um microscópio multifotônico equipado com um laser infravermelho (ver Tabela de Materiais), uma objetiva de imersão em água de longa distância 40X Apo (N.A. 1.15), um scanner galvanômetro e uma câmara ambiental que contém um inserto para quatro placas de Petri de 35 mm. As imagens foram adquiridas com um detector não escaneado (R-NDD).

1. Antes da imagem, equilibre a câmara ambiental para obter 5% de CO₂ / atmosfera de ar. Certifique-se de que placas de Petri vazias sejam inseridas no suporte para evitar vazamento de gás na sala.
2. Ligue o sistema de microscopia.
3. Uma vez que a câmara ambiental esteja equilibrada, adicione o líquido de índice de refração na objetiva de imersão em água de longa distância 40X Apo (N.A. 1.15).
   NOTA: O líquido de índice de refração com propriedades ópticas semelhantes à água é usado para evitar a evaporação da água durante a aquisição de imagens de longo prazo.
4. Coloque placas fluoradas com explantes retinianos na câmara. Usando luz de campo claro, posicione a amostra no caminho da luz e traga a região média da retina dorsal para o plano de foco.
5. Use a luz epifluorescente GFP para focar nos núcleos da glia de Müller gfap:nGFP-positive (Figura 1A, C).
   NOTA: Se os explantes não forem montados planos ou a agarose acumulada sob o explante, será difícil focar nos núcleos gfap:nGFP-positivos ou eles ficarão fracamente fluorescentes.
   1. Verifique se a mudança para uma região diferente dentro do mesmo explante de retina superará o problema de foco. Caso contrário, mude para um explante retiniano diferente.
6. No software de aquisição de imagem, abra as janelas 'A1 MP GUI', 'TiPad', 'A1 Compact GUI' e 'ND acquisition'. Para imagens multifotônicas, certifique-se de que a opção 'IR NDD' seja escolhida na 'GUI compacta A1'.
7. No campo 'configuração', selecione IR-DM para o 1º espelho dicróico e escolha o filtro passa-banda 525/50 para adquirir fluorescência GFP.
8. Ligue o laser IR na janela denominada 'A1MP GUI'. Levará alguns minutos para que o laser esteja pronto. Defina o comprimento de onda para 910 nm para excitar a fluorescência GFP e alinhe o laser clicando no botão 'Alinhamento automático' na janela 'A1 MP GUI'.
9. Certifique-se de que as luzes da sala e do equipamento estejam desligadas ou cobertas antes de abrir o obturador na 'GUI A1 MP' para evitar a superexposição do tubo fotomultiplicador. Para reduzir os níveis de ruído, coloque o microscópio em um ambiente escuro.
10. Adquira imagens de um campo de visão de 300 x 300 pixels, com um zoom de dois e um tempo de permanência de pixels de 4,8 μs/pixel. Configure aproximadamente a potência do laser alterando a 'área de aquisição' na 'GUI A1MP' e o ganho na janela 'A1 Compact GUI'.
11. Configurando o z-stack
    1. Concentre-se na camada de células ganglionares (GCL) para definir o plano focal superior da pilha z na subjanela 'z' dentro da janela 'ND acquisition'. Algumas células gfap:nGFP-positivas estão tipicamente localizadas na camada de células ganglionares, o que ajuda a identificar o limite basal da retina (Figura 1A, D).
    2. Mova o plano focal através do nível da camada nuclear externa (ONL) (Figura 1A, B), que é caracterizada pela presença de células gfap:nGFP-positivas vagamente marcadas que são redondas e aumentadas em relação às suas contrapartes na camada nuclear interna (INL) (Figura 1A, C).
    3. Defina este plano como a parte inferior da pilha z. Certifique-se de que todo o ONL será fotografado (Figura 1A, B).
    4. Ao experimentar mudanças no plano focal que exigem reajuste durante o período de imagem, clique duas vezes na posição intermediária na subjanela 'z' para atribuí-la como a posição 'inicial'. Mude para 'modo simétrico definido' e clique em 'relativo'.
    5. Defina o tamanho do passo z entre 0,7 a 1 μm.
12. Correção de intensidade Z:
    1. Aplique correções de intensidade z para compensar a perda de intensidade de pixel devido ao espalhamento de luz ao obter imagens em camadas profundas do tecido.
    2. Para configurar a correção, abra a janela 'correção de intensidade z'. Para definir o 'intervalo z-stack', escolha 'From ND'.
    3. Clique no plano focal inferior na janela 'correção de intensidade z' (neste caso, corresponde à camada de células ganglionares) e defina a intensidade do laser ('área de aquisição' na 'GUI A1MP') e o ganho (GUI compacta A1).
    4. Clique na seta ao lado dos 'valores z' na janela 'correção de intensidade z' para confirmar as configurações que são mostradas posteriormente em 'configurações do dispositivo' na janela 'correção de intensidade z' para o plano focal escolhido.
    5. Repita o processo para os planos médio e superior, aumentando a potência e o ganho do laser. Planos focais adicionais podem ser adicionados, se necessário. Consulte a Tabela 1 para configurações específicas de laser e ganho para experimentos nas Figuras 1 - 3.
    6. Defina a 'área de aquisição' na janela 'A1 MP GUI'. Evite selecionar uma área de aquisição maior que 15 e um ganho maior que 126 no início da imagem para contornar o fotobranqueamento e o aumento dos níveis de ruído.
       NOTA: Como os lasers e os tubos fotomultiplicadores diferem entre os sistemas de microscopia, teste as configurações de laser e ganho para obter as condições ideais de imagem para a configuração do microscópio, evitando o fotobranqueamento.
    7. Escolha 'correção de intensidade relativa' na janela 'correção de intensidade z'.
13. Na subjanela 'séries temporais' na janela 'ND aquisição', defina a duração para 8 h e o intervalo para 'sem atraso'. Em seguida, certifique-se de clicar em 'Executar correção z' na subjanela 'z-stack' no botão da janela 'Aquisição ND' para adquirir as séries temporais 3D.
14. Mantenha os explantes retinianos a uma temperatura de 27 - 29 °C durante toda a duração da aquisição da imagem.
15. Durante todo o período de aquisição da imagem, se necessário, reajustar o nível de potência e o ganho para manter a qualidade da imagem para análise pós-imagem. Para ajustes, execute as etapas 1.11.2 a 1.11.4.
16. Se o plano focal mudar, pause ou pare a execução e execute a etapa 1.11 novamente.
    NOTA: Se a 'correção z relativa' foi escolhida na etapa 1.12.7 e a etapa 1.11.4 foi executada, não deve ser necessário reajustar os níveis de potência e ganho, a menos que tenha ocorrido fotobranqueamento extenso.

Tabela 1: Níveis de laser e ganho usados para correções de intensidade Z nos diferentes planos para experimentos exibidos nas Figuras 1 - 3.

	Tg[gfap:EGFP]nt11		Tg[rho:Eco.NfsB-EGFP]nt19
		Ganho	de potência do laser	Ganho
Superior (fotorreceptor de bastonete)	13	126	3,5	118
Médio (glia de Muller)	10	126	2,8	118
Inferior (camada de células ganglionares)	8	126	2,1	118

Resultados

Figura 1: Reconstrução 3-D de pilhas Z multifotônicas da retina. Uma reconstrução 3-D ) de uma série de imagens multifotônicas z-stack de células gfap:nGFP- em culturas retinais de montagem total de peixe-zebra após 48 h de danos causad...

Materiais