Imagem de danos cerebrais induzidos por hipóxia-isquemia cerebral em um modelo de camundongo

Resumo

Fonte: Ouyang, Y., et al. Imagem simultânea de PET/MRI durante hipóxia-isquemia cerebral de camundongo. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra uma técnica para avaliar a lesão por hipóxia cerebral por meio de tomografia por emissão de pósitrons (PET) e ressonância magnética (MRI) simultâneas. Um camundongo anestesiado é submetido à ligadura da artéria carótida comum (CCA), reduzindo o fluxo sanguíneo para um hemisfério cerebral e predispondo-o a lesões induzidas por hipóxia. A PET e a ressonância magnética avaliam o metabolismo da glicose e as alterações estruturais durante a hipóxia. A ressonância magnética detecta difusão restrita de água, enquanto a PET revela captação reduzida de glicose, indicando estresse celular induzido por hipóxia e comprometimento metabólico.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Ligadura unilateral da artéria carótida comum (CCA)

1. Prepare o campo estéril com ferramentas e materiais cirúrgicos esterilizados posicionados convenientemente. Certifique-se de que a almofada de aquecimento esteja aquecida a 37 °C com a sonda de temperatura colocada firmemente na almofada. Certifique-se de usar uma cortina estéril para cobrir o local da cirurgia.
2. Anestesiar o animal (isoflurano, 1-3% no ar a 0,5-1 L/min) e colocá-lo em decúbito dorsal com a cauda voltada para o lado. Verifique a anestesia beliscando o dedo do pé - isso não deve provocar nenhuma reação se o animal estiver devidamente anestesiado. Aplique pomada oftálmica nos olhos.
3. Aplique o creme de depilação na parte inferior do pescoço até a parte superior do tórax usando 1-2 cotonetes. Aguarde 1-3 min e, em seguida, remova o cabelo e o creme usando gaze úmida ou cotonetes com álcool. Esfregue a área da incisão com Betadine de forma circular de dentro para fora e, em seguida, troque por luvas cirúrgicas estéreis.
4. Usando uma tesoura cirúrgica, faça uma incisão de cerca de 1 cm ao longo da linha média da parte inferior do pescoço. Separe cuidadosamente a pele externa da fáscia circundante usando uma tesoura cirúrgica.
5. Usando duas pinças de sutura de micro íris McPherson, separe a artéria carótida comum direita da fáscia, tomando cuidado para evitar danificar as veias ou perturbar o nervo vago.
6. Usando a pinça à direita, exteriorize o CCA direito em uma posição estável. Aplique várias gotas de soro fisiológico para evitar o ressecamento. Passe um comprimento adequado (2-3 cm) de sutura de seda 6-0 por baixo do CCA direito e ligue usando um nó quadrado duplo. Opcionalmente, ligue novamente usando um segundo comprimento de sutura de seda 6-0.
7. Reposicione o CCA direito e limpe o excesso de fluido da abertura usando um cotonete com ponta de esponja estéril. Feche a incisão com sutura de seda 6-0. Aplicar lidocaína topicamente até 7 mg/kg.
8. Permita que o animal se recupere da anestesia até o ambulatório (aproximadamente 30 min) e realize o monitoramento pós-cirúrgico até que o animal esteja pronto para a imagem.

2. Preparação para imagens: verificações de sistema e hardware

1. Configure hardware e software para os sistemas de ressonância magnética e PET e verifique sua funcionalidade da seguinte forma. Certifique-se de que todas as conexões físicas estejam seguras e que as configurações de software estejam selecionadas adequadamente.
   1. Certifique-se de que o sistema PET esteja na temperatura operacional prescrita de 5 °C usando o sistema de resfriamento a ar.
   2. Monte o sistema PET dentro do orifício de ressonância magnética, alinhando os centros de campo de visão (FOV) de PET e ressonância magnética usando deslocamentos axiais conhecidos. Monte a bobina de ressonância magnética dentro do orifício do sistema PET e centralize a bobina com o sistema PET e os centros magnéticos de ressonância magnética.
   3. Ligue os componentes eletrônicos PET para alimentação e tensão de polarização (Observação: as etapas variam de acordo com o instrumento). Execute uma varredura rápida (5 min) usando um cilindro de 68Ge e verifique o sinograma resultante para garantir que todos os detectores estejam operacionais.
   4. Opcionalmente, adquira dados a serem usados para uma matriz de transformação PET/MRI para fins de co-registro: Preencha um simulador tridimensional (por exemplo, três esferas preenchidas) com 200 μCi de solução aquosa 18F e adquira por 15 min com PET. Adquira dados anatômicos de ressonância magnética: na janela de controle de varredura, selecione a sequência multi-slice multi-echo (MSME) (consulte a Tabela 1). Repita para todas as três orientações principais: axial, sagital e coronal.
2. Verifique as configurações e o funcionamento da bomba de infusão. Defina a bomba para 4,44 μl por minuto, que em 45 minutos de infusão constante fornece um volume total de 200 μl, o limite típico recomendado para injeção intravenosa (i.v.) em um animal de 20 g.
3. Verifique o funcionamento do aquecedor e confirme se a saída de temperatura é suficiente para manter o animal aquecido (37 °C). Verifique se o monitoramento de temperatura e respiratório está operacional em preparação para a colocação do animal no leito do animal.
4. Verifique a operação dos medidores de vazão de O2 e N2 (para 0.5 L/min: O2 a 57.2 mg/min e N2 a 0.575 g/min) ligando ambos com a fonte de ar comprimido desligada e as fontes de O2 e N2 ligadas. Para evitar o risco de danificar os medidores de vazão, não os ligue sem pressão de entrada suficiente.
5. Certifique-se de que o vaporizador de isoflurano esteja suficientemente cheio. Antes da imagem, inicie o fluxo anestésico com isoflurano a 1-2% e 0.5 a 1 L/min.
6. Prepare a cama do animal garantindo que os sistemas de anestesia, almofada respiratória e aquecedor estejam posicionados de forma segura e funcional. Para precisão adicional de co-registro de PET/RM, marcadores fiduciais (por exemplo, tubos capilares cheios de radiotraçador em uma concentração semelhante à injetada para imagem) podem ser anexados ao leito do animal dentro do campo de visão.

3. Fluxo de trabalho de imagem

Após a conclusão de todas as verificações necessárias do equipamento, proceda à imagem da seguinte forma:

1. Anestesiar o animal com isoflurano e inserir cateter de veia caudal (agulha 28 G, tubo PE-10 com menos de 5 cm) preenchido com solução salina heparinizada (0,5 ml de heparina, 1.000 USP/ml, em solução salina de 10 ml). O aquecimento do animal e/ou da cauda pode melhorar a precisão da inserção do cateter. Opcionalmente, coloque uma gota de adesivo de cianoacrilato no local de inserção para prender a linha IV.
2. Transfira o animal para a cama de animais preparada. Certifique-se de que a cabeça do animal esteja segura, com os incisivos superiores presos pela barra de dente e pelas barras auriculares no lugar, se estiver sendo usado.
3. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento. Insira o termômetro de sonda retal. Certifique-se de que as leituras de temperatura e respiração estejam funcionais.
4. Extrair a dose do radiotraçador (cerca de 600 μCi em 200 μl) a injetar num tubo de PE-10 heparinizado de comprimento adequado – aproximadamente 3 m para o tubo de PE-10 e um volume de 200 μl. Ligar uma extremidade deste tubo à seringa da bomba de perfusão e a outra à linha do cateter da veia da cauda, tomando cuidado para não criar furos na tubulação.
5. Deslize a cama do animal para a frente no orifício do ímã, certificando-se de não perturbar o posicionamento da bobina de ressonância magnética e de quaisquer linhas ou cabos, especialmente o tubo de anestesia. Certifique-se de que o centro do cérebro esteja alinhado com os centros da bobina de ressonância magnética, sistema PET e ímã de ressonância magnética.
6. Execute o ajuste e a correspondência da bobina de ressonância magnética girando os botões de ajuste na bobina, minimizando as incompatibilidades de impedância (verifique as especificações da bobina) e frequência (300 MHz para 1H a 7 Tesla) observando a exibição do pré-amplificador de alta potência.
7. (MRI) Depois de ajustar e combinar, adquira uma imagem de reconhecimento: selecione uma sequência tripiloto de imagem rápida com ecos refocados (RARE) e execute a sequência na janela de controle de varredura. Verificar o posicionamento do animal, repetindo os passos 3.5 e 3.6 conforme necessário. Redefina os shims para o valor zero.
8. (MRI) Adquira uma varredura espectroscópica localizada e resolvida por pontos (PRESS) em um volume dentro do cérebro: Execute uma sequência PRESS (consulte a Tabela 1) em um volume retangular com dimensões de 3,9 mm × 6 mm × 9 mm. Verifique a largura da linha de água usando o comando macro CalcLineWidth. Se o valor de largura total na metade do máximo (FWHM) for aceitável (por exemplo, 0.2 ppm), continue na etapa 3.10. Caso contrário, prossiga para a etapa 3.9.
9. (MRI) Adquirir um mapa de campo: Execute uma sequência FieldMap (consulte a Tabela 1). Use os dados resultantes para um calço de projeção multi-ângulo (MAPSHIM) executando o comando de macro MAPSHIM e selecionando ajustes locais lineares e de segunda ordem (z2). Repita a etapa 3.8.
10. (MRI) Posicione o plano de fatia para a varredura de imagem ponderada por difusão (DWI) (consulte a Tabela 1): usando o Editor de geometria, certifique-se de que o FOV de aquisição esteja posicionado para adquirir o volume desejado de interesse dentro do cérebro. Se o plano de fatia resultante estiver alinhado conforme desejado, copie esse plano de fatia na Janela de Controle de Varredura para todas as varreduras DWI subsequentes. Comece a aquisição.
11. (PET) Com a aquisição de PET preparada e pronta para começar, ligue a bomba de infusão. Após o atraso pré-determinado em que a solução salina do cateter foi injetada, inicie a aquisição do PET (ver Tabela 1) para capturar a entrada do radiotraçador. Monitore a taxa de contagem e procure um aumento gradual nas contagens indicativas de uma injeção bem-sucedida.
12. Após 10-15 min, inicie o desafio hipóxico simultaneamente com a etapa 3.12. Para iniciar o desafio hipóxico, desligue o fluxo de ar medicinal e ligue imediatamente os medidores de vazão de O2 e N2 com as configurações predeterminadas para fornecer 8% de oxigênio e 92% de nitrogênio e reduzir o isoflurano para 0,8%. Não ligue medidores de vazão sem pressão de entrada.
13. (MRI) Ao mesmo tempo que a etapa 3.12, inicie a aquisição de DWI preparada na etapa 3.10 (varredura "H1").
14. (MRI) Inicie a aquisição de DWI (varredura "H2"), preparada na etapa 3.10, imediatamente após a conclusão da varredura H1. Acabe com o desafio hipóxico desligando os medidores de vazão, restaurando o fluxo de ar medicinal e retornando a concentração de isoflurano a um valor adequado com base no monitoramento fisiológico.
15. (MRI) Adquira uma varredura DWI pós-hipóxia preparada na etapa 3.10. Desligue a bomba de perfusão após a conclusão desta análise.
16. (RM) Adquirir imagens anatômicas nos planos axial e sagital. Na janela de controle de varredura – selecione a sequência MSME (consulte a Tabela 1). Usando o Editor de geometria, certifique-se de que o FOV de aquisição cubra o cérebro.
17. Retirar o animal, retornar à gaiola quando ambulatorial e monitorar sinais de morbidade, eutanasiar se necessário com administração de CO2 seguida de luxação cervical como método secundário.

Tabela 1. Parâmetros de sequência de pulso de ressonância magnética para exames descritos no protocolo e parâmetros de aquisição, histograma e reconstrução de PET.

Parâmetros de aquisição de imagem e aquisição de hardware
Diffusion MRI (EPI-DWI)
Tempo de aquisição 15	min
Tamanho da matriz	256 x 64
Fatias	10
FOV	30 x 14 x 8 mm
Tamanho do voxel	0,117 x 0,219 x 0,8 mm
Largura de banda espectral efetiva	150 kHz
TE	41 ms
TR	3.000 ms
Média de	6
segmentos do espaço k	16
valores b	0, 400, 800 seg/mm2
Ressonância magnética anatômica (MSME)
Tempo de aquisição	5 min
Tamanho da matriz	256 x 256
Fatias	16
FOV	30 x 22 x 12,8 mm
Tamanho do voxel	0,117 x 0,086 x 0,8 mm
TE	14 ms
TR	1.000 ms
Médias 1
Repetições	1
Varredura Espectroscópica Resolvida em Pontos (PRESS)
Tempo de aquisição	15 s
Tamanho do voxel	3,9 x 6 x 9 mm
TE	20 ms
TR	2.500 ms
Médias	6
FieldMap
Tempo de aquisição	1 min 21 seg
1º TE	1,49 ms
2º TE	5,49 ms
TR	20 ms
Médias	1
Aquisição de PET, histograma, e Parâmetros de Reconstrução
Tracer	[18F]FDG
Taxa de infusão	4,44 μL/min
Tempo de aquisição	60 min
Tamanho da imagem por fatia	128 x 128
Fatias	99
Tamanho do voxel	0,4 x 0,4 x 0,6 mm
Enquadramento dinâmico	12 x 300 seg
Tipo de reconstrução	OS-MLEM (6 subconjuntos, 6 iterações)

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cirurgia
Tesoura cirúrgica	Roboz	RS-5852
Pinça		de mosquito Hartman
	Miltex	7-26
2x pinças de sutura McPherson, 8.5 cm	Instrumentos Cirúrgicos e Científicos Precisos	4473	É útil reduzir a largura de abertura com uma faixa na pinça usada para segurar a artéria carótida
6-0 sutura de seda trançada revestida de silicone com agulha 3/8 C-1	Covidien Sofsilk	S-1172
	Aparelho Harvard	507220F
Super Medidor
para O₂	Alicat Scientific	MC-500SCCM-D
Flometer para N₂	Alicat Scientific	MC-5SLPM-D
Medidor de O₂	MSA	Altair Pro
Imaging
Sistema de ressonância magnética de 7,05 Tesla	Bruker	BioSpec	Diâmetro interno do furo de 20 cm com conjunto de gradiente. Software Paravision 5.1.
Bobina de volume Tx / Rx 1H,	PET Bruker	T8100
	de identificação (interno)		detectores 4x24 LSO-PSAPD,
matriz LSO 10x10 por detector,
passo de cristal de 1,2 mm e profundidade de 14 mm. PSAPD de 14 x 14 mm. FOV: 60x35mm. Janela de energia de 350-650 keV. Janela de temporização de 16 ns.
Pinça de canulação de vaso Dumont	Roboz	RS-4991
PE-10 tubo de polietileno	BD Intramedic	427401
Bomba de infusão	Braintree Scientific	BS-300
Equipamento de monitoramento e gating de animais	Small Animal Instruments Inc.	Modelo 1025	Apenas monitoramento de respiração usado
Cama de animal com regulação de temperatura	(internamente)

Sistema de manta homeotérmica de vazão de hipóxia de cola (genérico) sistema de 35 mm