Imagem de lapso de tempo de células primárias do córtex cerebral de camundongo transfectadas

Resumo

Fonte: Landeira, B. S.,et al., Imagens ao vivo de células primárias do córtex cerebral usando um sistema de cultura 2D. J. Vis. Exp. (2017)

O vídeo demonstra o uso de imagens de lapso de tempo para rastrear progenitores corticais marcados com fluorescência, monitorar sua divisão e diferenciação e estudar o desenvolvimento da linhagem em células primárias do córtex cerebral

Protocolo

1. Videomicroscopia com lapso de tempo

NOTA: Esta etapa requer um microscópio de fluorescência invertida com uma câmara de incubação (consulte Tabela de Materiais).

1. Após a infecção por retrovírus, coloque a placa de cultura de tecidos em uma incubadora conectada aos controladores de temperatura e CO₂.
   NOTA: O pré-aquecimento da câmara por 3 h antes de iniciar a aquisição pode ajudar a minimizar o desvio e a desfocagem durante a aquisição.
   NOTA: A câmara deve manter as células em condições constantes de 37 °C e 5% de CO₂.
2. Selecione uma posição no eixo XY para servir como ponto zero (XY = 0). Isso permitirá uma referência para encontrar as posições novamente no futuro.
   NOTA: É aconselhável desenhar um sinal na placa que possa ser usado como referência para determinar o ponto zero.
3. Selecione as posições a serem fotografadas com ampliação de 10X.
   NOTA: Selecione 10-15 posições por poço para aumentar a probabilidade de observar células transfectadas retroviralmente.
   NOTA: Objetivas de alta ampliação de longa distância (20X ou 40X) podem ser usadas para obter imagens de alta resolução. Dependendo da distância de trabalho das objetivas, podem ser necessárias placas com fundo de vidro.
4. Adquira imagens de contraste de fase a cada 5 min e imagens de fluorescência a cada 3 h para diminuir a fototoxicidade. Verifique e ajuste o foco nas primeiras 3 h do experimento, pois ele pode mudar enquanto a temperatura se equilibra. Verifique e ajuste o foco diariamente.
   NOTA: Observamos que o foco se torna estável após as primeiras 24 h. No entanto, é aconselhável monitorar o foco. Como alternativa, use um sistema de foco automático baseado em software.
5. Após 7 dias, interrompa a aquisição.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
ImageJ	NIH
tTt	ETH Zurich
Microscópio observador de células	Zeiss
O software		https://www.bsse.ethz.ch/csd/software/ttt-and-qtfy.html

Tracking Tool (tTt)