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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.
1. Coloração fluorescente de interneurônios vivos
1. Transfira as fatias cerebelares com uma pipeta Pasteur truncada de vidro largo para uma placa de 6 poços (máximo de 3 fatias/por poço). Aspirar o meio de solução salina balanceada de Hanks (HBSS).
2. Incubar fatias (3 max) em 5 ml de solução de carga do corante fluorescente (10 μM).
3. Para proteger da luz, cubra a microplaca com papel alumínio. Coloque-o em uma mesa giroscópica a 35 rpm por 10 min em RT para facilitar a marcação das células.
4. Transfira as fatias na membrana de um inserto Transwell (tamanho de poro de 3,0 μm; Figura 1D) com uma pipeta Pasteur truncada de vidro de diâmetro largo. Aspirar o meio de carga com uma pipeta.
5. Remova a inserção e encha o poço com 1,9 ml de meio de águia modificado de Dulbecco (DMEM). Substitua a inserção e adicione 100 μl de DMEM no topo da fatia para cobrir o tecido.
6. Coloque a placa contendo as inserções de cultura na câmara da incubadora (37 °C, 5% CO2) por 2 horas, o que é suficiente para observar células granulares (GCs) na camada molecular (ML). Deite os tecidos planos para permitir a fixação na membrana de inserção (Figura 1E). Certifique-se de que as fatias não estejam secando.
2. Imagem ex vivo através de macroscopia confocal
1. Transfira a placa sem a tampa de plástico para uma incubadora presa ao suporte de um macroscópio confocal. Coloque uma tampa de vidro na inserção da placa do macroscópio. Manter a temperatura da câmara a 37,0 °C ± 0,5 °C e alimentar as fatias com um fluxo de gás constante (95% O2, 5% CO2) através do inserto da placa para manter o pH constante. Aguarde 2 horas adicionais antes do experimento de lapso de tempo.
2. Para visualizar a migração de GC nas fatias de tecido, ilumine a preparação com uma luz de comprimento de onda de 488 nm por meio de um diodo laser através de um macroscópio confocal de varredura a laser equipado com uma objetiva seca X2 (distância de trabalho: 39 mm, diâmetro: 58 mm, NA = 0,234) e detecte a emissão de fluorescência de 500 a 530 nm.
1. Para resolver com precisão o movimento de GCs, adquira imagens com um fator de zoom óptico adicional de 1,5 a 2,0. Colete imagens de GCs em um único plano focal ou até 10 planos focais diferentes ao longo do eixo z a cada 30 minutos por até 12 horas.
3. Quando necessário, remova a tampa de vidro e adicione pequenos volumes (1-10 μl) de ativadores ou inibidores biológicos no DMEM com uma pipeta de 10 μl para estudar seu efeito na migração de GC.
3. Rastreamento de células
1. Para cada vez do filme, execute a projeção z-stack através do modo do tipo ecart no ImageJ. Modular os níveis de contraste e brilho das imagens sucessivas para facilitar a identificação e o rastreamento de GCs rotulados. Mapeie manualmente cada posição no instantâneo de referência (em t = 0).
1. Use o plugin "Rastreamento manual" no menu Analisar partículas e determine clicando no ponto de gravidade de cada corpo celular durante o lapso de tempo. Exporte os dados brutos de rastreamento em uma planilha.
2. Reorganize os dados brutos de rastreamento exportados do ImageJ com um programa caseiro inteligente que identifica cada célula e as posições associadas. Usando o programa, calcule a distância total percorrida e a velocidade média de migração para cada célula. Classificar e comparar as características da migração celular em condições de controle e tratamento sob filtros apropriados usando o mesmo programa.
