Imagem de lapso de tempo da divisão de células-tronco neurais de camundongo usando microscopia confocal

Resumo

Fonte: Daynac, M., et. al. Classificação celular de células-tronco neurais e progenitoras da zona subventricular de camundongos adultos e imagens ao vivo de sua dinâmica do ciclo celular. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra imagens de lapso de tempo de células-tronco neurais (NSCs) de um cérebro de camundongo transgênico usando um microscópio confocal de varredura a laser. Os NSCs fluorescem em vermelho durante a fase G1 e não são fluorescentes em outras fases do ciclo celular. Uma cultura de NSC aderida é colocada na câmara de imagem, os parâmetros de imagem são definidos e as imagens são capturadas em intervalos regulares pela duração desejada.

Protocolo

1. Configuração básica antes da cultura e videomicroscopia

1. Use placas de cultura com fundo de vidro ou placas μ para microscopia de vídeo confocal. Para 1 - 5 x 10³ células/poço, use placas de 96 poços, e para mais de 5 x 10³ células/poço, use placas de 24 poços.
2. Pelo menos um dia antes do início do experimento, prepare placas revestidas de poli-D-lisina (PDL) estéreis para culturas de monocamada aderentes. Adicionar PDL suficiente (10 μg/ml em água destilada ou dH₂O) para revestir o fundo de cada alvéolo e incubar durante a noite (O/N) a 37 °C. Retirar a solução de PDL e enxaguar três vezes com dH₂O antes de deixar a placa secar na campânula durante, pelo menos, 2 horas sob um fluxo laminar. Se não for usado imediatamente, armazene a placa revestida a -20 °C.
3. Prepare o meio de cultura misturando o meio basal de células-tronco neurais (NSC) e o suplemento de proliferação NSC na proporção de 9:1 (consulte a tabela de materiais) junto com 2 μg/ml de heparina, fator de crescimento epidérmico recombinante humano purificado (EGF) de 20 ng/ml e fator de crescimento de fibroblastos recombinantes humanos 2 (FGF-2) de 10 ng/ml. Aquecer o meio de cultura a 37 °C em banho-maria antes da utilização.
4. Para a dissociação da zona subventricular (SVZ), prepare a solução de papaína: 1 mg / ml de papaína (15 UI / ml) em solução salina Earl's Balance (EBSS) contendo 0,2 mg / ml de L-cisteína, 0,2 mg / ml de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e 0,01 mg / ml de DNase I em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Esterilizar a solução passando-a através de um filtro de 0,2 μm. Equilibre a solução a 37 °C antes de usar.
5. Para interromper a reação enzimática, prepare uma solução inibidora de protease (Ovomucó): meio de águia modificado de dulbecco (DMEM):Meio F12 contendo 0,7 mg/ml de inibidor de tripsina tipo II. Filtrar a solução com um filtro de 0,2 μm.
6. Prepare a solução de glicose PBS 0,6% para coletar os cérebros e a solução de albumina de soro bovino (BSA) PBS 0,15% para as etapas de lavagem e coloração de anticorpos.
7. Prepare ferramentas de dissecação: tesoura, pinça de dissecação e amarração e bisturi. Mergulhe-os em etanol 70%.

2. Colheita de cérebros de camundongos adultos e microdissecções SVZ

1. Sacrificar camundongos adultos com indicador de ciclo celular de ubiquitinação por fluorescência (FUCCI) (2 a 3 meses de idade e/ou 12 meses para estudos de envelhecimento), realizando uma luxação cervical de acordo com as diretrizes institucionais apropriadas.
2. Pulverize o mouse com etanol 70% e corte a cabeça com uma tesoura afiada.
3. Faça uma incisão ao longo do couro cabeludo para revelar o crânio.
4. Faça um corte longitudinal da linha média começando na base do crânio em direção aos bulbos olfatórios usando uma pequena tesoura. Certifique-se de evitar danificar o cérebro subjacente com as lâminas da tesoura. Remova a parte superior aberta do crânio com uma pinça curva para expor o cérebro.
5. Colete o cérebro em uma placa de Petri de 15 mm contendo 0,6% de glicose em PBS.
6. Disseque os bulbos olfativos. Coloque o cérebro em sua superfície dorsal e faça uma seção coronal através do quiasma óptico usando um bisturi.
7. Sob um microscópio de dissecação, posicione a parte rostral da seção cerebral com a superfície coronal cortada voltada para cima em direção ao experimentador.
8. Para dissecar a SVZ, remova o septo com uma pinça curva fina, insira uma ponta de uma pinça fina no estriado imediatamente adjacente ao ventrículo e desprenda a SVZ do tecido circundante. Coloque a SVZ dissecada em uma placa de Petri contendo 1 ml de glicose PBS-0,6%.

3. Dissociação de tecido SVZ

1. Pique a SVZ dissecada na placa de Petri até que não restem pedaços grandes.
2. Transfira o tecido picado junto com a glicose PBS-0,6% para um tubo de 15 ml e centrifugue a 200 x g por 5 min.
3. Rejeitar o sobrenadante e adicionar 1 ml de papaína pré-aquecida (1 mg/ml, preparada no passo 1.4) suplementada com 0,01 mg/ml de DNase I. Incubar durante 10 min em banho-maria a 37 °C. Utilizar 1 ml de papaína por ratinho.
4. Centrifugue a 200 x g durante 5 min e elimine o sobrenadante.
5. Adicione 1 ml de ovomucóide pré-aquecido (0,7 mg/ml, preparado no passo 1.5) para parar a atividade da papaína. Dissocie mecanicamente o tecido picado em uma suspensão de célula única, pipetando suavemente para cima e para baixo 20 vezes através de uma ponta de micropipeta p1000. Evite bolhas de ar.
6. Passe a suspensão celular por um filtro estéril de 20 μm em um novo tubo de 15 ml. Certifique-se de lavar o filtro de células com PBS 0.15% BSA para evitar a perda de células.
7. Centrifugue a 200 x g durante 10 min e elimine o sobrenadante. Ressuspenda as células em 100 μl de PBS contendo 0,15% de BSA.

4. Coloração imunofluorescente para classificação de células

Para classificação de células usando camundongos FUCCI-Red (Figura 1A), use os seguintes anticorpos: CD24 conjugado ficoeritrina-cianina7 [PC7]; CD15/LeX isotiocianato de fluoresceína [FITC] conjugado e ligante EGF conjugado com Ax647.

Nota: As células LeX ⁺ EGFR ⁺ e EGFR ⁺ não são abundantes na SVZ adulta: ≈ 600 e 1500 células / camundongo, respectivamente. Recomendamos agrupar células SVZ de 2 a 3 camundongos para ter material suficiente. Não trabalhe com mais de 12 camundongos no mesmo dia para que a duração da classificação das células não exceda 3 horas. Lembre-se de que trabalhar com muitos camundongos no mesmo dia levará a um aumento da duração da classificação celular, possivelmente resultando em aumento da morte celular e/ou diferenciação celular.

1. Realize a coloração FACS em 100 μl de PBS 0,15% BSA por camundongo (ou em 200 μl para um grupo de 2 a 3 camundongos para uma coloração ideal).
2. Prepare os tubos de controle. Use contas de compensação para preparar tubos de controle de cor única de acordo com o protocolo do fabricante. Selecione uma fração de células (1/10 das células extraídas de um camundongo é suficiente) e separe-a em 4 tubos para preparar 1 tubo de controle negativo (células não marcadas) e 3 tubos de controle de fluorescência menos um (FMO). Ressuspenda as células em 200 μl de PBS 0,15% BSA por tubo.
   Dica: Para controle LeX-FITC FMO, rotule as células com ligante EGF conjugado com CD24-PC7 (1:50) e Ax647 (1:200); para controle de FMO CD24-PC7, rotule as células com ligante EGF conjugado com CD15/LeX-FITC (1:50) e Ax647 (1:200) e para controle FMO de ligante EGF conjugado com Ax647, rotule as células com CD15/LeX-FITC (1:50) e CD24-PC7 (1:50).
3. Para os tubos usados para classificação de células, use os seguintes anticorpos na diluição indicada em PBS 0,15% BSA: CD24-PC7 (1:50), CD15 / LeX-FITC (1:50) e ligante EGF conjugado com Ax647 (1: 200).
4. Incubar durante 20 min a 4 °C no escuro. Lave com 1 ml de PBS 0,15% BSA e centrifugue a 200 x g por 10 min. Ressuspenda as células em 200 μl de PBS 0,15% BSA por cérebro. Mantenha os tubos de classificação de células no gelo e prossiga imediatamente para a classificação de células.
5. Se estiver usando camundongos FUCCI-Green, separe as frações LeX-positivas e LeX-negativas usando colunas de separação antes da classificação das células, pois o anticorpo LeX-FITC compartilha o mesmo comprimento de onda de emissão que a fluorescência verde FUCCI (Figura 2A, B).
   1. Primeiro, rotule as células com um anticorpo LeX humano de camundongo (1:50) por 15 minutos a 4 °C no escuro em 100 μl de PBS 0,15% BSA.
   2. Lave as células com 1 ml de PBS 0,15% BSA e centrifugue a 200 x g por 10 min, depois rotule as células com microesferas IgM anti-mouse (1:10) por 15 minutos a 4 ° C no escuro.
   3. Lave as células com 1 ml de PBS 0,15% BSA e centrifugue a 200 x g por 10 min. Ressuspenda as células em 500 μl de PBS 0,15% BSA e despeje as células através da coluna de separação no campo magnético, conforme esquematizado na Figura 2C. Lavar a coluna com 1 ml de PBS 0,15% BSA para obter a fracção negativa LeX.
   4. Para obter uma fração LeX-positiva, remova a coluna de separação do campo magnético e elua as células com 2 ml de PBS 0,15% BSA.
   5. Proceder à coloração dos ligantes EGF conjugados com CD24-PC7 e Ax647 conforme indicado em 4.2.

5. Classificação de células

Nota: As células foram classificadas em um classificador FACS a 40 Psi com um bico de 86 μm. A fluorescência foi coletada usando o seguinte conjunto de filtros: 520/35nm (FITC), 575/26nm (PE), 670/20nm (Ax647) e 740LP (PC7). A compensação é necessária para evitar sinais falso-positivos, pois é encontrada sobreposição entre os espectros de emissão da fluorescência vermelha FUCCI e do corante PC7.

1. Imediatamente antes da classificação das células, adicione um corante vital para discriminar as células vivas das mortas. Usamos Hoechst (HO) (ver tabela de materiais) em uma concentração final de 2 μg/ml. Passe o tubo de controle negativo (células não marcadas) através do classificador FACS e selecione as células usando os parâmetros de dispersão lateral (SSC) e dispersão direta (FSC) (Figura 3A).
   NOTA: As células mortas foram excluídas por gating apenas a fração negativa de HO (Figura 3A) e, em seguida, os dupletos foram excluídos selecionando a fração negativa de largura de pulso (Figura 3A).
2. Execute os controles de cor única preparados na etapa 4.2 e ajuste as tensões do tubo fotomultiplicador (PMT), se necessário (ou seja, população negativa muito alta e/ou células positivas fora de escala). Execute a compensação de cores na janela de compensação do software.
3. Execute os controles FMO preparados na etapa 4.2 (controle LeX-FITC FMO, controle CD24-PC7 FMO e controle FMO do ligante EGF conjugado com Ax647) e desenhe as portas de classificação (Figura 3). Classificar as células directamente em 100 μl de meio de cultura em microtubos de 1,5 ml.

6. Preparação de células para placa de microscopia

1. as células recém-selecionadas a uma densidade de 1 - 3 x 10³ células/poço em placa de μ de 96 poços revestida com poli-D-lisina com 300 μl de meio de cultura.
2. Antes da microscopia de vídeo, incube as placas de cultura a 37 °C e 5% de CO₂ por pelo menos 1 hora para permitir a adesão celular.

7. Configuração do microscópio e aquisição de imagens

1. Realize imagens ao vivo usando uma objetiva Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) em um sistema de microscópio confocal de varredura a laser conectado a uma câmara termostatizada invertida a 37 °C sob uma atmosfera de 5% de CO₂.
2. Posicione a placa de μ de 96 poços dentro da câmara termostatizada pré-aquecida e equilibrada e recoloque a tampa por uma tampa termostatizada.
3. Abra o software NIS-Elements e clique na barra de menu em "Controles de aquisição/aquisição/aquisição ND" para selecionar as opções de lapso de tempo (comprimento, stage posições, seções z confocais,...), "Controles de aquisição/aquisição/Ti Pad" para selecionar as objetivas e "Controles de aquisição/aquisição/Configurações A1plus" para selecionar o nível PMT para cada fluorescência na barra de menus. Selecione uma pasta para salvar os arquivos de dados.
4. Usando a janela de aquisição ND, defina o centro de cada poço como uma posição de palco e selecione a opção de imagem grande para 7 x 7 mm². Isso criará uma imagem em mosaico ao redor do centro de cada poço. Defina a sobreposição da imagem em mosaico grande para 5%. Tire fotos a cada 20 minutos por 24 horas. Selecione a objetiva Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0.75) na janela Ti Pad.
5. Na janela Configurações do A1plus, adquira imagens usando um scanner ressonante de alta velocidade no formato de 512 x 512 pixels com resolução de 1,26 μm/pixel. Use o campo claro para visualizar as formas das células. No caso dos ratinhos FUCCI-Red, excitar a fluorescência vermelha a 561 nm e recolher utilizando um filtro de 595/50 nm. No caso dos ratinhos FUCCI-Green, excitar a fluorescência verde a 488 nm e recolher utilizando um filtro de 530/40 nm. Determine o nível ideal de PMT, deslocamento e potência do laser para cada comprimento de onda.
   NOTA: Recomendamos o uso da função de foco automático para o canal de campo claro para permitir que o software foque automaticamente em cada stage posição antes de cada aquisição. Dica: Uma objetiva Plan Apo VC 20x DIC (NA: 0,75) foi usada por sua excelente resolução sem a necessidade de óleo. Outras objetivas podem ser usadas dependendo da resolução óptica desejada.
6. Selecione o botão 'Executar agora' na janela de aquisição ND para iniciar a aquisição.

Resultados

Figura 1: Análises ao vivo do ciclo celular usando camundongos FUCCI-Red. (A) Representação esquemática do ciclo celular FUCCI-Red, onde as células são vermelho-fluorescentes durante o G₁ fase e incolor durante as fases S-G_2<...

Materiais