Imagem de lapso de tempo da divisão de células-tronco neurais de camundongo usando microscopia confocal

Resumo

Fonte: Daynac, M., et. al. Classificação celular de células-tronco neurais e progenitoras da zona subventricular de camundongos adultos e imagens ao vivo de sua dinâmica do ciclo celular. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra imagens de lapso de tempo de células-tronco neurais (NSCs) de um cérebro de camundongo transgênico usando um microscópio confocal de varredura a laser. Os NSCs fluorescem em vermelho durante a fase G1 e não são fluorescentes em outras fases do ciclo celular. Uma cultura de NSC aderida é colocada na câmara de imagem, os parâmetros de imagem são definidos e as imagens são capturadas em intervalos regulares pela duração desejada.

Protocolo

1. Configuração básica antes da cultura e videomicroscopia

1. Use placas de cultura com fundo de vidro ou placas μ para microscopia de vídeo confocal. Para 1 - 5 x 10³ células/poço, use placas de 96 poços, e para mais de 5 x 10³ células/poço, use placas de 24 poços.
2. Pelo menos um dia antes do início do experimento, prepare placas revestidas de poli-D-lisina (PDL) estéreis para culturas de monocamada aderentes. Adicionar PDL suficiente (10 μg/ml em água destilada ou dH₂O) para revestir o fundo de cada alvéolo e incubar durante a noite (O/N) a 37 °C. Retirar a solução de PDL e enxaguar três vezes com dH₂O antes de ....

Resultados

Figura 1: Análises ao vivo do ciclo celular usando camundongos FUCCI-Red. (A) Representação esquemática do ciclo celular FUCCI-Red, onde as células são vermelho-fluorescentes durante o G₁ fase e incolor durante as fases S-G_2<.......

Materiais

< >< table class = 'ck-table-resized'> < col style = 'width: 25%;'>< col style = 'width: 25%;'> Lista de materiais utilizados neste artigo Nome Empresa Número de catálogo Comentários 96 placas de cultura de fundo de vidro não revestidoMatTek Corp.P96G-1.5-5-F μ-Placas 96-wellIbidi89626 Poly-D-LysineMilliporeA003E NeuroCult NSC Basal MediumSTEMCELL Technologies5700 NeuroCult NSC Suplemento de ProliferaçãoSTEMCELL Technologies5701 HeparinaSTEMCELL Tecnologias7980 EGFMilliporeGF144 FGF-2MilliporeGF003 PapainWorthingtonLS003119 EBSSInvitrogen24010-043 L-cisteínaSigmaC-7352 0.5M EDTA, pH 8.0PromegaV4231 DNase ISigmaD5025-15KU Inibidor de tripsina tipo IISigmaT9128OvomucoidDMEM:F12 meioLife Technologies31330-038 Filtro de 20 μmBD Medimachine Filcon340622 Eppendorf microtubos 3810XSigmaZ606340-1000EA BSASigmaA1595Solução de albumina de soro bovinoCD24 conjugado de ficoeritrina-cianina7 [PC7]Life TechnologiesA14776IgM de camundongo; clone MMA. 1:50CD15/LeX isotiocianato de fluoresceína [FITC] - BD Biosciences conjugado332778IgG2b de rato; clone M1/69. 1:50Anticorpo de camundongo anti-humano LeXBD Pharmingen559045IgM de camundongo; clone MAM. 1:50Alexa647 - ligante EGF conjugadoLife TechnologiesE353511:200; Ligante EGF conjugado com Ax647CompBeadsBD Biosciences644204 colunas de separação MACS LSMiltenyi Biotec130-042-401Colunas de separaçãoMicroesferas IgM anti-ratoMiltenyi Biotec130-047-301 Hoechst 33258Sigma861405 INFLUX classificador de célulasBD Biosciences Classificador FACSSistema de microscópio confocal de varredura a laser Nikon A1R conectado a um ECLIPSE Ti invertido NikonCorp. Microscópio confocal de varredura a laserNIS-Elements AR.4.13.01 software de 64 bitsNikon Corp. NIS-Elements softwarePlan Apo VC 20x DIC objetiva (NA: 0.75)Nikon Corp. Câmara termostatizada ECLIPSE TiNikon Corp. Câmara termostatizadaImageJRBS FlowJoTree Star, Ashland, OU FUCCI ratosRIKEN BioResource Center, JAPÃO