Imagem microendoscópica de cálcio em tempo real em um camundongo que se move livremente

Resumo

Fonte: Lee, H. et. al., Imagem de cálcio in vivo bem-sucedida com um microscópio miniaturizado montado na cabeça na amígdala de um camundongo que se comporta livremente. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra imagens de cálcio in vivo em um camundongo usando um índice de refração gradiente, ou lente GRIN, e um microscópio miniaturizado. A configuração combina a fixação da cabeça dentro de um sistema de gaiola móvel sem atrito, estimulando os neurônios e desencadeando o influxo de íons de cálcio. A lente GRIN captura a sinalização de cálcio no cérebro, permitindo a visualização em tempo real da atividade neuronal.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

NOTA: Este protocolo consiste em seis etapas principais: cirurgia de injeção de vírus, cirurgia de implante de lente de índice de refração gradiente (GRIN), validação do implante de lente GRIN, fixação da placa de base, registro óptico do sinal GCaMP (fusão de proteína fluorescente verde (GFP), calmodulina (CaM) e M13, uma sequência peptídica da miosina quinase de cadeia leve) durante um teste de comportamento e processamento de dados (Figura 1A). Com exceção da cirurgia, é utilizado o pacote de software comercial (Inscopix).

1. Cirurgia estereotáxica – Injeção de vírus adeno-associado (AAV)
NOTA: A cepa de camundongo usada neste procedimento cirúrgico é C57BL6/J. O corpo do animal é coberto com uma cortina estéril durante a cirurgia, e todas as etapas do protocolo são realizadas com o uso de luvas estéreis. Cirurgias múltiplas geralmente não são realizadas no mesmo dia. No entanto, se vários camundongos tiverem que fazer a mesma cirurgia no mesmo dia, use um conjunto separado de ferramentas cirúrgicas autoclavadas para cada camundongo e etanol a 70% para desinfetar os instrumentos cirúrgicos entre os camundongos. Para manter o mouse aquecido durante o procedimento cirúrgico, o mouse é coberto com um cobertor cirúrgico feito sob medida após ser fixado à estrutura estereotáxica.

1. Desinfete todas as ferramentas cirúrgicas necessárias com etanol a 70% e prepare uma seringa Hamilton e uma pipeta de vidro. Encha a pipeta de vidro com água destilada.
   NOTA: Todas as ferramentas cirúrgicas utilizadas no protocolo são autoclavadas. Como a lente GRIN e os parafusos do crânio não podem ser autoclavados para esterilização, o etanol a 70% é usado como desinfetante para prevenir a inflamação. Embora não tenha sido tentado, outras formas de esterilização podem ser usadas, por exemplo, esterilização a gás ou química.
2. Anestesiar o camundongo com pentobarbital (83 mg∙kg-1 de peso corporal) por injeção intraperitoneal. Depois que o rato ficar inconsciente, raspe o pelo do crânio.
3. Limpe a pele acima do crânio com etanol 70% e fixe o mouse na estrutura estereotáxica. Remova cuidadosamente a pele e limpe a superfície do crânio com uma solução de peróxido de hidrogênio a 35% usando um aplicador de ponta de algodão. Aplique pomada lubrificante para os olhos para evitar o ressecamento da córnea durante a cirurgia.
   NOTA: Embora geralmente não haja problema em usar etanol a 70% apenas para a preparação asséptica da pele, recomenda-se o uso de 3 rodadas alternadas de desinfetante, por exemplo, iodóforos ou solução de clorexidina e etanol a 70%. Uma concentração mais alta de peróxido de hidrogênio é usada neste protocolo para garantir que o tecido conjuntivo no crânio do camundongo seja removido o mais completamente possível, o que é fundamental para reduzir os artefatos de movimento durante a imagem posterior, porque o tecido conjuntivo no crânio interfere com uma fixação firme da placa de base ao crânio. Deve-se notar que 35% de peróxido de hidrogênio é muito maior do que o normalmente usado (3%).
4. Fixe o pino com um suporte de sonda estereotáxica. Alinhe a altura do bregma e lambda com o pino.
5. Encontre a localização específica no crânio do camundongo para craniotomia.
   NOTA: As coordenadas da amígdala lateral (LA) para injeção de vírus são (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,5 mm, -4,3 mm) de bregma neste protocolo (AP; Ântero-Posterior, ML; Médio-Lateral, DV; Dorsal-Ventral, cada abreviatura indica a distância axial relativa do bregma). As coordenadas devem ser otimizadas para cada condição experimental.
6. Perfure a superfície do crânio (Figura 1B). Lave as frações do crânio com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Remova a camada restante usando uma pinça ou uma agulha de 27 G.
   1. Ao perfurar o crânio, tente não tocar na última camada de dura-máter para evitar danificar a superfície do tecido cerebral. Uma superfície cerebral danificada causa inflamação ao redor da lente, o que induz artefatos de movimento graves e alta autofluorescência durante a gravação. A craniotomia é de 1,6 mm. A velocidade da broca é de 18.000 rpm e o tamanho da broca é de 0,6 mm.
7. Para abaixar a lente GRIN da superfície do tecido cerebral do local perfurado até o local alvo da amígdala, calcule a distância denominada "Valor A" subtraindo a diferença DV entre o bregma e a superfície cerebral exposta da coordenada DV do implante da lente, que é definida com base no bregma (4,2 mm neste caso, Figura 1C).
8. Carregue 3 μL de óleo mineral e 0,7 μL da solução do vírus AAV na pipeta de vidro.
   NOTA: O óleo mineral ajuda a separar a solução do vírus e a água. 0,7 μL é um volume otimizado para a injeção do vírus LA que pode cobrir totalmente o AL.
9. Remova o pino do suporte da sonda estereotáxica e fixe a pipeta de vidro nele.
10. Localize a pipeta de vidro no local de injeção mencionado no passo 1.5. Insira a pipeta de vidro no tecido cerebral depois que o sangramento estiver completamente parado.
11. Libere o vírus através de uma pipeta de vidro usando uma bomba injetora.
    NOTA: O título do vírus deve ser superior a 1 x 1013 vg/mL para obter um número suficiente de células que expressam GCaMP. A velocidade de injeção é de 0,1 μL/min e difusa por 10 min. Se houver sangramento, lave a superfície do cérebro com PBS. Mantenha a superfície do cérebro molhada nesta etapa.
12. Depois de terminar a injeção, remova a pipeta de vidro lentamente.

2. Cirurgia estereotáxica – Implante de lente GRIN
NOTA: A cirurgia de implante de lente GRIN é a etapa mais crítica neste protocolo. Como uma velocidade lenta consistente do movimento da lente GRIN é fundamental para o implante bem-sucedido da lente GRIN, um braço de cirurgia motorizada pode ser útil. O braço de cirurgia motorizada é um manipulador estereotáxico controlado por software de computador. Embora o braço motorizado seja usado neste protocolo, outras formas também podem ser usadas, desde que a lente se mova de forma consistente e lenta durante o implante. Informações detalhadas sobre o dispositivo estão na Tabela de Materiais.

1. Perfure o crânio para implantar dois parafusos de crânio. Lave todas as frações do crânio com PBS.
   NOTA: Para reduzir os artefatos de movimento em imagens ópticas posteriores, são necessários pelo menos dois parafusos. Os dois parafusos de crânio e a posição do implante da lente GRIN formam um triângulo equilátero (Figura 1B). O tamanho da craniotomia deve se ajustar perfeitamente ao diâmetro do parafuso. Se houver sangramento, lave a superfície de sangramento com PBS. A velocidade da broca é de 18.000 rpm e o tamanho da broca é de 0,6 mm.
2. Desinfete os parafusos com etanol a 70% para evitar inflamação. Implante os parafusos o mais fundo possível.
   NOTA: Os parafusos devem ser firmemente fixados sem aderência adicional, como cimento.
3. Instale um braço de cirurgia motorizado na estrutura estereotáxica. Conecte o hardware necessário ao laptop no qual o software de controle está instalado (Tabela de materiais).
4. Antes de abaixar a lente GRIN, prepare-se para fazer um trajeto de agulha com uma agulha de 26 G.
   NOTA: O trajeto de agulha é uma espécie de trilho guia que ajuda a implantar a lente GRIN relativamente espessa em regiões profundas do cérebro, como a amígdala, sem causar distorção grave da estrutura cerebral ao longo do caminho da injeção. Esta trilha guia é chamada de trilha de agulha porque é feita por um procedimento de abaixamento e elevação de uma agulha relativamente fina de 26 G.
5. Encaixe o suporte da cânula para segurar a agulha de forma estável na estrutura estereotáxica.
6. Segure a agulha de 26 G com o suporte da cânula e calcule as coordenadas do local de inserção da agulha.
   NOTA: Neste protocolo, as coordenadas do local de inserção da agulha são 50 μm laterais do local de injeção do vírus (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -3,7 mm).
7. Acesse o software de controle e complete a preparação para manipular a posição da agulha.
   1. Execute o software de controle e selecione o botão Iniciar novo projeto para iniciar a sessão de controle.
      OBSERVAÇÃO: Na sessão de controle, há várias caixas em branco e botões de menu. As caixas em branco são espaços de entrada para coordenadas. Depois de inserir as coordenadas nas caixas em branco, o braço estereotáxico motorizado se move clicando no botão Ir para. O botão Ir para se transforma em um botão STOP quando o braço estereotáxico está se movendo. Entre vários botões de menu, apenas o botão Ferramenta é necessário neste protocolo.
   2. Clique no botão Ferramenta. Calibre o software de controle clicando no botão de menu Calibrar o quadro. A calibração é o processo pelo qual a posição real do manipulador é definida como valores no software Stereodrive.
8. Localize a ponta da agulha na superfície exposta do cérebro na superfície do crânio usando um manipulador estereotáxico.
   NOTA: A velocidade da agulha é definida usando o menu de velocidade do Microdrive no menu Ferramentas. A velocidade padrão é de 3,0 mm/s. No entanto, uma velocidade de 0,5 mm/s é recomendada nesta etapa. O movimento da agulha é controlado pelas teclas de seta.
9. Adicione 2-3 gotas de PBS para manter a superfície do cérebro molhada. Preencha a caixa em branco na tela do computador com as coordenadas DV apropriadas do LA. Se a superfície do cérebro estiver seca, isso dificulta a penetração da agulha no tecido cerebral.
10. Abaixe a agulha de 26 G clicando no botão Ir para. Ele para automaticamente quando a agulha atinge o local de destino definido pelas coordenadas DV. A velocidade da agulha é de 100 μm/min. Se houver sangramento, pare a agulha clicando no botão STOP e lave a superfície do cérebro com PBS. Mantenha a superfície do cérebro molhada nesta etapa. Depois que o sangramento for interrompido, comece a abaixar novamente.
11. Depois que a agulha parar completamente de se mover, digite 45,00 mm na caixa em branco na tela do computador.
    NOTA: 45,00 mm é um valor da coordenada DV que faz com que a agulha retorne à posição inicial.
12. Eleve a agulha clicando no botão Ir para. A velocidade do movimento da agulha é de 100-200 μm/min.
13. Depois que a agulha parar de se mover, remova o PBS da superfície do cérebro. Desinstale a agulha e o suporte da cânula da estrutura estereotáxica. O experimentador pode parar manualmente a agulha clicando no botão STOP quando necessário.
14. Equipe a haste estereotáxica com o suporte da lente. Instale a lente GRIN no suporte da lente.
    NOTA: A lente GRIN otimizada para direcionar o LA (0,6 mm de diâmetro, 7,3 mm de comprimento) é usada neste protocolo. Se o suporte da lente não estiver preparado, uma maneira alternativa é usar um clipe de buldogue para segurar a lente GRIN.
15. Desinfete a lente com etanol 70% e prenda a haste estereotáxica nas armações estereotáxicas.
16. Localize a ponta da lente GRIN no local designado na superfície do crânio (mesmo método descrito na etapa 2.8).
    NOTA: A coordenada da lente GRIN é (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -4,2 mm) (Figura 1C). A lente não deve tocar no crânio para evitar danos à sua ponta.
17. Calcule a coordenada DV subtraindo o valor absoluto de "Valor A" da coordenada DV do implante da lente descrita na etapa 2.16.
18. Solte 2-3 gotas de PBS na superfície do cérebro. Digite 1000 μm para abaixar e 300 μm para levantar a lente na caixa em branco na tela do computador.
19. Repita o abaixamento (1000 μm para baixo) e o aumento (300 μm para cima) da lente GRIN até atingir o local alvo. Este procedimento para cima e para baixo é usado para ajudar a liberar a pressão gerada dentro do tecido cerebral devido ao procedimento de abaixamento da lente que, de outra forma, pode causar distorção das estruturas cerebrais ao longo do caminho de implantação.
    NOTA: A velocidade do movimento da lente GRIN é de 100 μm/min. Mesmo se houver sangramento, não pare de mover a lente GRIN e lave a superfície do cérebro com PBS. Mantenha a superfície do cérebro molhada nesta etapa. Se a superfície do cérebro estiver seca, o tecido cerebral adere à superfície da lente GRIN e causa distorção da estrutura cerebral.
20. Se a lente GRIN atingir o local alvo, remova o PBS e aplique cuidadosamente o cimento dentário de resina ao redor da lente GRIN, dos parafusos e de sua parede lateral (Figura 1D).
    NOTA: A aplicação do cimento resinoso em todo o crânio pode reduzir os artefatos de movimento. Pelo contrário, se o cimento resinoso cobrir acidentalmente os músculos ligados ao crânio, ele aumenta os artefatos de movimento.
21. Após o endurecimento do cimento dentário de resina, desmonte a lente GRIN do suporte da lente e aplique cimento acrílico em todo o crânio (Figura 1D).
22. Para fixar a placa de cabeça, desmonte o suporte da lente da haste estereotáxica e prenda a placa de cabeça na ponta da haste usando fitas. Confirme se a placa de cabeça está na horizontal.
    NOTA: Uma placa de cabeça inclinada causa uma visualização inclinada. Uma placa de cabeça é necessária para fixar a cabeça do mouse no sistema de gaiola da casa móvel (na seção de fixação da placa de base). Se o experimentador não usar o sistema, pule esta etapa (etapa 2.22) e a etapa 2.23 seguinte.
23. Abaixe lentamente a haste até que a placa da cabeça esteja localizada na parte superior do manguito da lente. Abaixe a placa da cabeça em mais 1000 μm. Mova a placa de cabeça para a lente GRIN implantada para colocá-la na borda direita do anel interno da placa de cabeça.
    NOTA: A placa de cabeça deve ser posicionada abaixo da superfície da lente GRIN implantada; caso contrário, o microendoscópio não pode se aproximar o suficiente da lente GRIN implantada para ajustar o plano focal devido ao cimento acrílico.
24. Aplique cimento acrílico para prender a placa da cabeça às camadas de cimento (Figura 1D).
25. Fixe filme de parafina na superfície da lente GRIN implantada para proteger a superfície da lente contra poeira. Em seguida, aplique uma ligação epóxi removível no filme de parafina para manter o filme de parafina na superfície da lente.
26. Injete Carprofeno, um analgésico (0,5 mg/mL em PBS), e Dexametasona, uma solução de anti-inflamatório (0,02 mg/mL em PBS), na cavidade peritoneal do camundongo.
    NOTA: A dose do medicamento depende do peso corporal: Carprofeno (5 mg∙kg-1 de peso corporal) e Dexametasona (0,2 mg∙kg-1 de peso corporal). Tanto o carprofeno quanto a dexametasona são administrados após a cirurgia e uma vez ao dia durante 7 dias após a cirurgia.
27. Misture 0,3 mg / mL de amoxicilina, um antibiótico, na água da gaiola doméstica para administrar o medicamento por 1 semana.
28. Retorne o mouse para a gaiola inicial e aguarde de 5 a 8 semanas para recuperação e transdução do vírus.
    NOTA: O mouse é recuperado em uma gaiola pré-aquecida em um cobertor elétrico até que o mouse acorde do anestésico.

3. Validação do implante da lente GRIN
NOTA: A validação do implante da lente GRIN fornece informações sobre se a lente GRIN implantada está no alvo para as células que expressam GCaMP. Com base nessas informações, o experimentador economiza seu tempo em processos demorados, como o teste de comportamento e o processamento de dados, excluindo animais com implante de lente GRIN fora do alvo. Durante o procedimento de validação, as células com expressão de GCaMP devem ser focadas no campo de visão de gravação. Uma gaiola de casa móvel é usada nesta etapa. Uma gaiola de casa móvel é um aparelho especializado de formato redondo que permite que camundongos com cabeça fixa movam livremente suas pernas durante a validação do implante da lente GRIN e da fixação da placa de base. Uma mesa de transporte aéreo neste aparelho, na qual as pernas dos ratos com a cabeça fixa são colocadas, permite esse movimento livre das pernas, embora a cabeça seja fixa. As células no núcleo lateral da amígdala geralmente estão quietas em estado de repouso ou anestesiadas, de modo que os sinais de fluorescência do GCaMP raramente são detectados nessas condições, o que torna muito difícil, às vezes impossível, encontrar células que expressem GCaMP durante a validação do implante da lente GRIN e fixação da placa de base. No entanto, o movimento das pernas geralmente produz sinais de fluorescência GCaMP nas células do núcleo lateral da amígdala e, portanto, pode ajudar a localizar o microscópio. Assim, a gaiola da casa móvel é usada neste protocolo.

1. Monte o manipulador estereotáxico no sistema de gaiola da casa móvel.
2. Anestesiar o camundongo com gás isoflurano a 1,5%. Depois que o mouse estiver completamente inconsciente, coloque-o na barra de cabeça do sistema de gaiola da casa móvel.
3. Localize a gaiola de carbono sob o mouse. Feche a gaiola de carbono e ligue o fluxo de ar para que a gaiola se mova livremente sem atrito. Aguarde alguns minutos até que o mouse fique ativo.
   NOTA: A velocidade do fluxo de ar deve ser otimizada para cada condição experimental (aqui, 100 L/min).
4. Remova o filme de parafina e a ligação epóxi na superfície da lente GRIN implantada e limpe a superfície da lente com etanol a 70% usando papel para lentes.
5. Prepare o software de aquisição de dados (DAQ) (por exemplo, Inscopix). Defina as condições de imagem.
   NOTA: O software DAQ é usado para controlar o microscópio (potência do diodo emissor de luz (LED), foco da lente, etc.) e armazenamento de dados.
   1. Ligue a caixa DAQ e conecte um microscópio a ela. Em seguida, conecte-o a um laptop diretamente usando um cabo ou via internet sem fio.
      NOTA: O software DAQ é instalado no hardware extra chamado DAQ box (por exemplo, Inscopix). Ao conectar a caixa DAQ ao laptop, o software DAQ se torna acessível em um laptop.
   2. Acesse o software DAQ por meio de um navegador da Internet (recomenda-se o Firefox).
   3. Defina todos os detalhes necessários (data, ID do mouse, etc.) na sessão definida. Em seguida, clique em Salvar e continuar. Depois de salvar, acesse a sessão Executar.
   4. Na sessão de execução, defina as condições de imagem, como tempo de exposição, ganho, foco eletrônico e potência do LED de exposição.
      NOTA: O ganho e a potência do LED de exposição podem ser alterados dependendo das condições do laboratório. O valor recomendado para foco elétrico é 500 e o tempo de exposição é 50 ms. Não há restrição para alterar a potência e o ganho do LED. No entanto, uma intensidade mais alta de luz pode causar mais branqueamento. O tempo de exposição da gravação determina a taxa de quadros da gravação de vídeo. Taxas de quadros mais altas reduzirão a intensidade do sinal. As taxas de quadros devem ser otimizadas para os GECIs usados para a imagem.
6. Para segurar o microscópio em um manipulador estereotáxico, prenda a haste estereotáxica com uma garra de microscópio ao manipulador estereotáxico.
   NOTA: A garra é um pequeno acessório que pode ser conectado ao aparelho estereotáxico para segurar um corpo de microscópio para colocá-lo no local alvo do cérebro.
7. Segure o microscópio com a pinça do microscópio. Ligue a luz LED conectada ao microscópio e alinhe o microscópio verticalmente. Abaixe o microscópio enquanto observa a imagem até que a superfície da lente GRIN implantada apareça.
8. Alinhe o centro da lente GRIN implantada com o centro da visualização.
   NOTA: A validação do implante da lente GRIN pode ser realizada nesta etapa (mencionada na seção de resultados, Figura 2B, Figura 2D, Figura 2F).
9. Capture a imagem da superfície da lente GRIN implantada (clique no botão Prt Sc no teclado). A imagem da superfície da lente GRIN implantada é necessária para desmarcar componentes não neuronais durante o processamento posterior dos dados (etapa 6.8).
10. Encontre a posição apropriada do microscópio. Eleve lentamente a lente objetiva do microscópio enquanto observa a imagem para procurar células com expressão de GCaMP7b.
    NOTA: Pode ser necessário ajustar o ganho da aquisição da imagem ou a potência do LED de exposição. A validação do implante da lente GRIN pode ser realizada nesta etapa (mencionada na seção de resultados, Figura 2A, Figura 2C, Figura 2E).

Resultados

Figura 1: Fluxo de trabalho esquemático e diagramas para cirurgia estereotáxica para imagens microendoscópicas de cálcio in vivo no AE. (A) Um fluxo de trabalho esquemático de imagens microendoscópicas de cálcio in vivo no LA. (B) Uma imagem microscópica...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
26G agulha	BD	302002	Cirurgia
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE	Addgene	104493-AAV1	Cirurgia
AAV2/1-CaMKiiα-GFP	custom made		Surgery
Cimento acrílico-dental (Ortho-jet Acrílico Rosa)	Lang	1334-rosa	Cirurgia e fixação de placa de base
Manipulador de fluxo de ar Neurotar		NTR000253-04	Fixação de placa de base
Amoxicilina	SIGMA	A8523-5G	Cirurgia
Gaiola de carbono	Neurotar	180mm x 70mm	Fixação de placa de base
Carprofeno	SIGMA	PHR1452-1G	cirurgia
Software de processamento de dados	INSCOPIX	Software de processamento de dados INSCOPIX	Fixação da placa de base e teste de comportamento
Dexametasona	SIGMA	D1756-500MG	Broca de cirurgia
	Seyang	marathon-4
Broca de cirurgia	ELA	US1/2, Shank104	Cirurgia
Agulha de vidro	WPI	PG10165-4	Cirurgia
Lente GRIN (INSCOPIX Proview Lens Probe)	INSCOPIX	1050-002208	Cirurgia
Hamilton Seringa	Hamilton	84875	Cirurgia
Placa de cabeça	Neurotar	Modelo 5	Cirurgia
Computador portátil	Samsung	NT950XBV	Cirurgia
Suporte de lente, haste estereotáxica (kit de implante INSCOPIX proview)	INSCOPIX	1050-004223	Pinça
microscópio	INSCOPIX	1050-002199	Fixação da placa de base
Microscópio, software DAQ, hardware	INSCOPIX	nVista 3.0	Fixação da placa de base e teste de comportamento
Gaiola de base móvel	Neurotar	MHC V5	Fixação da placa de base
Braço motorizado	Neurostar	Cirurgia personalizada
Software de braço monitorado	Neurostar	Customized	Surgery
Removable epoxy bond	WPI	Kwik-Cast	Surgery
Resin cement (Super-bond)	Sun medical	Super bond C&B	Surgery
Skull screw	Stoelting	51457	Surgery
Stereotaxic frame	Stoelting	51600	Surgery
Stereotaxic manipulator	Fixação da	placa de base	51600

para cirúrgico Stoelting