Isolamento & Caracterização da Hoechst Baixa CD45 Negativo Mouse Células-Tronco Mesenquimais de pulmão

Summary

Neste artigo, vamos demonstrar o isolamento de murino residente de pulmão de células-tronco mesenquimais (MSC pulmão), sua expansão, caracterização e análise de propriedades imunomoduladores.

Abstract

Tecido residente células-tronco mesenquimais (MSC) são importantes reguladores de reparação tecidual ou regeneração, fibrose, inflamação, angiogênese e formação de tumores. Em conjunto, estes estudos sugerem que a MSC pulmão residentes desempenham um papel durante a homeostase do tecido pulmonar, lesão e reparo durante doenças como a fibrose pulmonar (PF) e hipertensão arterial (HAP). Aqui nós descrevemos uma tecnologia para definir uma população de MSC pulmão residente. A definição desta população no tecido pulmonar vivo usando um conjunto de definir marcadores facilita o isolamento repetido de uma população bem caracterizados com células-tronco por citometria de fluxo e do estudo de um tipo específico de célula e função.

Protocol

1. Isolamento de pulmão

1. Sacrifício ratos adultos (80-10 semanas de idade; 18-20 g; C57Bl6J) ratos com uma overdose de isoflurano seguido de sangria utilizando técnica estéril. Perfis variam ligeiramente entre cepas.
2. Remover cirurgicamente o diafragma, abrir a cavidade torácica, cortando as costelas lateralmente em cada lado do mouse. Lavar o sangue dos pulmões irrigando o ventrículo direito do coração delicadamente usando 3-5mls de tampão fosfato (PBS).
3. Dissecar os lobos pulmonares remoção traqueia e os brônquios grandes e coloque em um prato de petri preenchida com solução salina Hanks (HBSS). Após a coleta de todos os lobos pulmonares pinças são usadas para colocar o tecido sobre a tampa do prato. Tecido é então picada em pedaços pequenos utilizando bisturis descartáveis ​​com líquido suficiente para mantê-los úmidos, mas não tanto que eles flutuam e se mover.
4. Dissecar um membro posterior de um dos camundongos e isolar a medula óssea a ser usado como um controle de coloração para definir o flow citometria de portas. Mancha da medula óssea (BM) como descrito anteriormente ^1.

2. Preparação de uma suspensão de células do tecido pulmonar Único

1. Cada pulmão é digerido usando um tecido de peso otimizado para relação de volume de 0,2 g: 5mls da pré-aquecido 0,2% Worthington tipo 2 colagenase (Bioquímicos Worthington, Lakewood, NJ; # cat LS004202) dissolvida em HBSS estéril. A mistura é imersa em um banho de água 37 ° C por 30 min ^2,3.
2. Triturar amostra bem até digerir tecido pulmonar flui facilmente através de uma pipeta de 10ml (aproximadamente 10 repetições). Incubar por 15 minutos adicionais a 37 ° C para completar o tecido digere e garante uma suspensão de células mais uniforme único.
3. Diluir a suspensão de células de pulmão com HBSS e triturar com uma pipeta de 5 ml para dispersar fragmentos de tecido residual.
4. Filtrar a suspensão utilizando um coador de células 70μM para remover fragmentos de tecido sem serem digeridas. Amostra pode ser dividida em multipltubos cônicos e neste ponto para evitar a sobrecarga um coador de celular e diminuir o tempo.
5. Pellet da suspensão de células por 10 min a 1500 rpm e decantar o sobrenadante.
6. Ressuspender pellet celular usando delicadamente a temperatura ambiente RBC tampão de lise (eBiosciences, San Diego, CA; cat # 00-4333-57) e incubar a RT por 5 min. Adicionar um volume igual de HBSS para inativar o tampão de lise e filtrar a suspensão de células usando um coador de células 40μM para remover detritos e agregados celulares.
7. Pipetar 10μl de cada amostra a ser manchada e contagem de números de celular tanto para o pulmão e as amostras usando um hemocitômetro BM. Nota: registrar o volume total das células.
8. Pellet a suspensão única célula de células do pulmão por centrifugação a 1500 rpm por 10 min.
9. Ressuspender tanto pulmão e células BM em 1x10 ⁶ células / ml no pré-aquecida (37 ° C) DMEM + (meio modificado Dulbecco Águia, glicose elevada (Gibco, Carlsbad, CA; cat # 11965-092), contendo 2% Bovi fetalne soro (FBS) e HEPES 10mM.
10. Prepare uma solução estoque 1mg/ml de Hoechst 33342 dye (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; cat # B2261) em água e filtro de esterilizar ^1,4. O corante Hoechst pode ser armazenada como alíquotas a -80 ° C.
11. Adicionar corante Hoescht 33342 para uma concentração final de 5μg/ml (a diluição de 200x de um estoque 1mg/ml) para a suspensão única célula.
12. Misture delicadamente as células por inversão e incubar em banho-maria 37 ° C por exatamente 90 minutos.

3. Coloração e preparação da suspensão de células do pulmão para a Análise de Citometria de Fluxo

1. Depois de 90 min todos os passos com as células do pulmão Hoechst manchado deve ser executado a 4 ° C ou em gelo para evitar efluxo corante. Agregar as células por centrifugação a 1500 rpm por 10 min a 4 ° C e ressuspender as células em ice-cold coloração tampão (PBS 2% FBS).
2. Ressuspender as células em uma concentração não superior a 1x10 ⁷

1. >

&

Discussion

Nós adaptamos um método inicialmente utilizado para identificar BM células hematopoiéticas para isolar uma população específica de MSC pulmão residente. Devido à reprodutibilidade de isolamento dessas células foram então bem caracterizado como MSC. Sua origem tem sido definido como residente no pulmão do rato adulto (em oposição a BM derivados) e um perfil fenotípico e molecular documentada ^2. A capacidade de isolar essa população repetidamente caracterizada permite que o estudo mais aprofundado da importância biológica e papel da MSC pulmão durante homeostase do tecido e da doença. A definição recente da população in vivo tanto em camundongos e humanos tecido pulmonar facilita o desenvolvimento de uma estratégia terapêutica dirigida ao resgate de células endógenas para facilitar a reparação do pulmão durante a ferimentos e doenças.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comments (opcional)
Tampão fosfato (PBS)	Sigma	P-5368
Hanks solução tamponada de sal (HBSS)	Thermo Scientific	SH30588.01
0,2% Worthington tipo 2 colagenase	Bioquímicos Worthington	LS004202
Vermelhas do sangue tampão de lise celular	eBiosciences	00-4333-57
DMEM	Invitrogen Gibco	11965-092
Corante Hoechst 33342	Sigma	B2261
CD45-APC	BD PharMingen	559864
Iodeto de propídio	Sigma	81845
a-MEM	Thermo Scientific	SH30265.01	;
FBS	Invitrogen	16000-069
0,5% de tripsina / EDTA	Cellgro	25-053-Cl
Médio completo MesenCult	Stem Cell Technologies	05511
0,4% w / v solução de coloração Giemsa	Sigma	GS1L
Paraformaldeído a 4%	Microscopia eletrônica de Serviços	15710	Paraformeldehyde 16% é diluída a 4% com PBS
Carboxifluoresceína succinimidyl éster (CFSE)	Sigma	21888