Visualização do plexo coróide de um cérebro de camundongo usando microscopia eletrônica de varredura

Resumo

Fonte: Van Wonterghem, E., et al. Microdissecção e visualização de microscopia eletrônica de varredura de montagem inteira do plexo coróide de camundongo. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra a preparação e imagem do tecido do plexo coróide de um cérebro de camundongo usando microscopia eletrônica de varredura (MEV). O processo inclui fixação de tecido, desidratação e revestimento com uma camada condutora de platina para estabilizar e preparar a amostra para imagem. O SEM captura imagens detalhadas de células epiteliais com microvilosidades, fornecendo informações sobre as características estruturais do tecido.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Análise morfológica do tecido do plexo coróide (CP) usando microscopia eletrônica de varredura (MEV)

CUIDADO: Soluções tóxicas são usadas nas seguintes etapas de processamento. Recomenda-se realizar o preparo da amostra em capela de exaustão.

1. Execute a preparação da amostra para SEM conforme descrito abaixo.
   1. Transfira o PC isolado fresco para uma solução de fixação recém-feita contendo 2% de paraformaldeído e 2,5% de glutaraldeído em tampão de nacodilato 0,1 M (pH 7,4). Incubar durante a noite a 4 °C.
      NOTA: Como o tecido CP é muito frágil e fino, o tecido deve ser colocado em pequenos cestos de amostras (consulte Tabela de Materiais) para transferi-lo entre tampões. Desta forma, a estrutura do tecido será melhor preservada. Um fixador à base de cacodilato é usado em vez de um à base de solução salina tamponada com fosfato (PBS), pois o tampão de cacodilato forte pode combater o baixo pH do glutaraldeído no fixador EM.
   2. Lave a amostra 3x por 5 min cada com 3-5 mL de tampão Na-cacodilato 0,1 M (pH 7,4).
   3. Pós-fixar as amostras em 3-5 mL de tetróxido de ósmio a 2% em tampão de nacodilato 0,1 M por 30 min. Lave as amostras 3x por 5 min cada com 3-5 mL de água ultrapura.
   4. Desidrate as amostras em uma série de soluções geladas de concentrações crescentes de etanol (EtOH) (50%, 70%, 85%, 100%), por 15 min por solução de EtOH. Use um secador de ponto crítico para apontar adequadamente a amostra para secar. NOTA: A mudança da fase líquida para a fase gasosa afeta a tensão superficial, causando danos à estrutura da superfície. A etapa de secagem do ponto crítico permite a preservação da estrutura da superfície.
   5. Posicione a amostra cuidadosamente em um suporte de amostra fornecido com um adesivo de carbono (consulte Tabela de Materiais).
   6. Cubra as amostras com uma camada fina (2-5 nm) de platina. Para fazer isso, monte uma fonte de platina em um sistema de vácuo entre dois terminais elétricos de alta corrente e aqueça a platina até sua temperatura de evaporação. Um fino fluxo de platina é depositado na amostra. NOTA: Além da platina, ouro ou ouro/paládio também podem ser usados.
2. Visualize as amostras de CP com SEM (consulte Tabela de Materiais). O procedimento de visualização do tecido CP via SEM é semelhante ao de outros tipos de tecidos e depende do software usado e dos instrumentos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Suportes de amostra de alumínio	EM Sciences	75220
Tampão de cacodilato	EM Sciences	11652
Abas adesivas de carbono -12 mm	EM Sciences	77825-12
Secador de ponto crítico	Bal-Tec	CPD030
Crossbeam 540	Zeiss		Sistema SEM
Fórceps	Fine Science Tools GmbH	91197-00
Glutaraldeído	EM Sciences	16220
Tetróxido de ósmio	EM Sciences	19170
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	Lonza	BE17-516F
Platinum	Quorum	Q150T ES	PBS sem Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ ou vermelho de fenol; cesta de amostra filtrada estéril
inoxidável	EM Sciences	70190-01

aço