Imagem de fluorescência da dinâmica sináptica do cálcio em um modelo in vitro de esclerose lateral amiotrófica

Resumo

Fonte: Krishnamurthy, K. et al. Medição fluorescente em tempo real de funções sinápticas em modelos de esclerose lateral amiotrófica. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra imagens de cálcio em tempo real para monitorar a atividade sináptica em neurônios mutantes de ALS que expressam um biossensor de cálcio geneticamente codificado. Ele descreve as etapas para preparar os neurônios para imagens, estimular a dinâmica do cálcio e registrar a fluorescência para medir as mudanças em tempo real nos níveis de cálcio intracelular, que refletem a atividade sináptica neuronal.

Protocolo

1. Imagem de fluorescência de transientes de cálcio Gcamp6m

1. Transfect neurônios corticais primários de roedores cultivados em placas de fundo de vidro de 35 mm com 500 ng de Gcamp6m.
   NOTA: Se desejado, co-transfecte neurônios com um plasmídeo de interesse contendo uma etiqueta fluorescente na faixa vermelha ou vermelha distante.
2. Incube neurônios com baixo teor de cloreto de potássio (KCl) líquido cefalorraquidiano artificial (aCSF) (Tabela 1) por 15 min, 48 h após a transfecção e, em seguida, monte o prato na plataforma de imagem.
3. Visualize a fluorescência GCaMP6m usando um filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) (488 nm) e uma objetiva de 20x ou 40x.
4. Selecione o campo de imagem e ative o foco perfeito. Em seguida, tire uma única imagem estática com canais de campo claro, FITC e marcadores de fluorescência para marcar os limites neuronais.
5. Inicie Executar agora no software de aquisição. Realize o registro basal por 5 min e, em seguida, perfunda com aCSF contendo 50 mM de KCL (Tabela 1).
   NOTA: O objetivo desta imagem é medir os transientes evocados de cálcio. Se um neurônio tiver atividade de disparo basal e fluxos de cálcio durante o período de pré-estimulação, ele não será usado na análise de dados. Em vez disso, apenas células com fluorescência de fundo estável são usadas. Os períodos pós-estimulação também podem ser estendidos para 60 min para transientes de cálcio, com ou sem alta perfusão contínua adicional de KCl.
6. Salve o experimento e analise os dados usando um software confocal. O experimento pode ser interrompido neste ponto, e a análise pode ser realizada posteriormente.
   NOTA: Se as células não necessitarem de transfecção para a expressão de proteínas de interesse, este protocolo pode ser realizado a qualquer momento in vitro ao procurar examinar transientes de cálcio. Após um teste de células de controle para garantir a medição de transientes de cálcio, o experimentador deve ser cego para as condições genéticas ou farmacológicas de cada placa testada para minimizar o viés.

2. Análise de imagem

1. Abra imagens de lapso de tempo com software confocal.
2. Alinhar imagens em séries de lapso de tempo pela série de comandos: Imagem | Processamento | Alinhar documento atual. Selecione Alinhar ao primeiro quadro.
3. Selecione regiões de interesse (ROIs) ao longo de neurites usando a ferramenta de seleção de ROI, um ícone em forma de feijão à direita do quadro da imagem. Além disso, marque uma ROI que represente a intensidade da fluorescência de fundo.
   NOTA: As ROIs são selecionadas escolhendo áreas de pontos distintamente separados ao longo das trilhas neuronais indicadas pela imagem estática de campo claro. Pelo menos cinco ROIs por neurônio são escolhidas para análise. O ROI de fundo é escolhido em uma região do campo de visão que não contém neurites.
4. Meça a fluorescência bruta ao longo do tempo para ROIs selecionadas usando a seguinte série de comandos: Medir | Medição de tempo.
   1. Inicie a função Medir na parte superior do painel Medição de tempo. Uma representação gráfica da fluorescência bruta ao longo do tempo e dados quantitativos são gerados.
      NOTA: Cada ponto de dados representa a fluorescência bruta para esse ROI para o quadro associado a esse ponto de tempo medido específico.
5. Exporte intensidades de fluorescência brutas para o software de planilha.

Tabela 1: Composição dos tampões artificiais do líquido cefalorraquidiano (aCSF).

Baixo tampão KCL aCSF (pH 7,40 a 7,45)
Concentração	reagente
HEPES	10 mM
NaCl	140 mM
KCl	5 mM
Glicose	10 mM
CaCl2 2H2O	2
mM MgCl2 4H2O	1 mM
KCL alto tampão aCSF (pH 7,40 a 7,45)
Concentração de reagente
HEPES	10 mM
NaCl	95 mM
KCl	50
mM Glicose	10 mM
CaCl2 2H2O	2 mM
MgCl2 4H2O	1 mM

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