Microscopia holográfica de dois fótons para estudar a atividade neural e a conectividade em um modelo de camundongo

Resumo

Fonte: Kato, D. et. al., Avaliação e Manipulação da Atividade Neural Usando Microscopia Holográfica de Dois Fótons. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra a técnica de imagem de dois fótons combinada com optogenética usando microscopia holográfica. Usando um modulador de luz espacial, essa técnica permite a estimulação neuronal precisa expressando a proteína sensível à luz vermelha e a imagem de cálcio com fotodano mínimo. Essa abordagem fornece insights sobre a conectividade funcional e a organização das redes neurais.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Implante da placa da cabeça (Figura 1A)

1. Administre o anestésico (uma mistura de 74 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina) por via intraperitoneal para anestesiar o camundongo. Verifique o estado anestésico do camundongo com frequência, avaliando os reflexos dos pedais.
2. Após a anestesia, coloque o mouse em um instrumento estereotáxico. Aplique uma pomada para os olhos (consulte a Tabela de Materiais) para evitar que a córnea seque quando a placa principal for implantada.
3. Depile a área cirúrgica e desinfete a pele com três rodadas alternadas de esfoliantes com iodopovidona ou clorexidina, seguidas de lenços umedecidos com álcool 70%. Exponha cuidadosamente o crânio e limpe-o com cotonetes.
   NOTA: Todos os instrumentos cirúrgicos devem ser esterilizados e todos os procedimentos devem ser realizados de acordo. Quaisquer detritos remanescentes (por exemplo, cabelo ou sangue seco) causam reações inflamatórias. Portanto, quaisquer detritos devem ser removidos sob um estereoscópio usando cotonetes umedecidos com água estéril ou álcool 70%.
4. Use as coordenadas estereotáxicas - anterior e posterior = 0,5 mm, medial e lateral = 1,5 mm do bregma - para encontrar o centro da craniotomia e rotulá-la com um marcador.
5. Coloque uma placa de cabeça feita sob medida no centro do crânio. Em seguida, aplique cimento dental (consulte a Tabela de Materiais) para fixá-lo firmemente ao crânio. Aplique uma leve pressão até que a placa da cabeça faça contato firme com a frente e a parte de trás do crânio.
   NOTA: Esta etapa leva aproximadamente 20 minutos para ser concluída e é fundamental para reduzir os artefatos de movimento no cérebro durante a aquisição de imagens de dois fótons. As dimensões da placa de cabeça são 20 mm × 40 mm × 1 mm com uma abertura em forma de placa inicial com uma borda de 15 mm de comprimento, dois lados adjacentes de 3 mm de comprimento e os dois lados restantes de 10 mm de comprimento.
6. Misture um cimento de resina adesiva dental à base de acrílico da seguinte forma: meia colher de pó, três gotas de líquido e uma gota de catalisador (consulte a Tabela de Materiais). Para evitar o ressecamento, aplique este cimento de resina adesiva dental mista na superfície intacta do crânio do camundongo com a placa da cabeça.
7. Coloque o mouse em uma gaiola quente até que ele se recupere da anestesia. Não deixe o rato sem vigilância até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.

2. Cirurgia e injeção de vírus adeno-associado (AAV) (Figura 1B)

1. Realizar craniotomia ou injeção viral sem remoção do cimento de resina adesiva dental do crânio 1 dia após o implante da placa de cabeça.
   NOTA: Administrar anestesia (uma mistura de 74 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina) por via intraperitoneal ao camundongo durante este procedimento.
2. Para evitar edema cerebral, administrar dexametasona fosfato de sódio (1,32 mg/kg) por via intraperitoneal 1 h antes da cirurgia.
3. Anestesie o camundongo com a placa da cabeça com anestesia com isoflurano a 1% usando um vaporizador (sistema de administração de anestesia) enquanto mantém a temperatura corporal com uma almofada de aquecimento. Aplique uma pomada para os olhos para evitar o ressecamento da córnea.
4. Sob um estereoscópio, faça uma craniotomia circular de aproximadamente 2 mm de diâmetro usando uma broca odontológica. Para reduzir os danos cerebrais, opere a broca odontológica com cuidado com um leve movimento constante e uma leve pressão para baixo.
5. Remova os fragmentos ósseos várias vezes usando um sistema de sucção. Depois de remover os fragmentos ósseos, use uma solução de líquido espinhal artificial (ACSF) para remover e lavar quaisquer detritos remanescentes na superfície do cérebro. Repita este procedimento de limpeza várias vezes para suprimir as reações inflamatórias.
   NOTA: A solução de ACSF (cloreto de sódio 140 mM, NaCl, cloreto de potássio 2,5 mM, KCl, ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico 5 mM, HEPES, cloreto de cálcio 2,0 mM, CaCl₂ e cloreto de magnésio 1,0 mM, MgCl₂) foi armazenada a 4 °C por 1 mês após o reagente ter sido dissolvido e filtrado (tamanho dos poros = 0,22 μm).
6. Usando um sistema de injeção de pressão (consulte a Tabela de Materiais), defina a pressão apropriada (cerca de 10 libras por polegada quadrada (PSI) em pulsos com duração de 4 ms) para injetar 500 nL de solução de AAV através de um capilar de vidro com um diâmetro de ponta de 10-20 μm (preparado com um extrator de micropipeta) por 10 min.
7. Determine se a solução de AAV está sendo administrada ao cérebro, verificando se o nível da solução de AAV no capilar de vidro diminui gradualmente.
8. Deixe o capilar de vidro no lugar por mais 10 minutos para evitar o refluxo. Repita três vezes para administrar um total de 1,5 μL de solução de AAV no cérebro.
9. Para avaliar e manipular a atividade neural em células piramidais da camada 2/3 (L2/3), injete uma solução de AAV (para imagens de Ca²⁺: AAV2/1-Syn-jGCaMP8f-WPRE a 1,28 × 10¹⁴ genomas de vetores/mL, diluídos 1:1 em solução salina; para imagens de Ca²⁺ com optogenética: AAV2/8-CaMKII-GCaMP6m-P2A-ChRmine-Kv2.1-WPRE a 1,73 × 10¹⁴ genomas vetoriais/mL, diluídos 1:1 em solução salina) na área da pata traseira do córtex somatossensorial primário de camundongos do tipo selvagem (S1, centrado a 0,5 mm posterior e 1,5 mm lateral do bregma, 150 μm de profundidade da superfície).
   NOTA: A solução de AAV deve ser injetada 2-3 semanas e 1-2 semanas antes da imagem para a expressão de jGCaMP8f e GCaMP6m-P2A-ChRmine, respectivamente.
10. Após uma aplicação de agarose de baixo ponto de fusão a 2% (p / v) na superfície cerebral de S1 usando uma micropipeta, coloque uma janela de vidro sobre a craniotomia com duas copas de cobertura. Prenda os dois vidros de cobertura (pequeno de 2.0 mm de diâmetro e grande de 4.5 mm de diâmetro; consulte a Tabela de Materiais) com adesivo curável ultravioleta (UV).
11. Pressione a lamínula contra a agarose enquanto ela ainda está líquida; isso evita a formação de bolhas de ar na agarose. Sele as bordas da janela craniana com cimento dentário e resinoso adesivo (Figura 1C).
12. Remova o mouse do instrumento estereotáxico e devolva-o à sua gaiola. Coloque o camundongo em uma gaiola quente e não retorne à gaiola com outros animais até que ele esteja totalmente recuperado da anestesia. Mantenha cuidadosamente as condições estéreis durante a cirurgia de sobrevivência.
13. Nas primeiras 72 horas após a cirurgia, verifique o estado de saúde do camundongo observando o comportamento geral. Se houver alguma anormalidade no comportamento geral, injete agentes anti-inflamatórios e analgésicos por via subcutânea.

3. Preparação para o sistema de estimulação ou iluminação holográfica (Figura 2)

1. Calibre o sistema de estimulação holográfica colocando a superfície de uma lâmina de fluorescência vermelha (substrato acrílico fundido) no plano da amostra. Coloque o microscópio no modo de imagem ao vivo com uma luz de excitação fraca e execute o arquivo calibration_GUI.m. Verifique o painel de parâmetros e clique no botão Salvar.
2. Clique no botão Z Scan no painel da etapa 1. Ele gerará automaticamente três pontos aleatórios em todos os 21 planos axiais, separados por 2 μm de cada plano.
3. Mova a barra deslizante e verifique a imagem ao vivo. Encontre um plano perfeito onde os pontos apareçam menores e mais brilhantes e clique no botão Salvar. Isso gerará automaticamente uma frente de onda esférica deslocada para o holograma digital.
   NOTA: Se você não conseguir encontrar os pontos de fluorescência mais brilhantes, altere os valores mínimo e máximo da faixa de varredura e tente novamente.
4. Clique no botão Ir no painel da etapa 2 e, em seguida, clique em seis pontos no quadrado esquerdo. Verifique a imagem ao vivo. Se houver seis pontos de fluorescência distinguíveis, digite os eixos x e y nas caixas de edição e clique no botão Salvar. Isso gerará automaticamente coeficientes de transformação afim para coordenar a calibração entre a estimulação holográfica e o sistema de imagem.
   NOTA: O número do par de eixos e o número do ponto clicado devem ser correspondidos em ordem. Se não tiver certeza, ou se não houver manchas em sua imagem, tente novamente e gere um padrão de manchas exclusivo ou escolha um intervalo menor ao redor do centro do campo de visão (FOV).
5. Clique no botão Digitalizar no painel da etapa 3. Ele gerará 441 hologramas digitais para realizar a varredura de ponto único no FOV em 21 × 21 etapas.
   1. Primeiro, verifique as imagens enquanto altera os padrões na caixa de listagem. Em seguida, ajuste a potência do laser para obter imagens pontuais dentro da faixa dinâmica do dispositivo de imagem (por exemplo, para evitar imagens excessivamente saturadas).
   2. Em seguida, ajuste o tempo de intervalo na caixa de edição; o tempo de intervalo deve ser mais de duas vezes o tempo de intervalo de gravação. Por fim, coloque o dispositivo de imagem no modo de gravação e clique no botão Reproduzir. Se a reprodução for concluída, haverá strings "exibir OK" mostradas na janela de comando. Pare a gravação e empilhe as imagens sequenciais gravadas usando o método de intensidade máxima.
6. Clique em Gerar WM no painel da etapa 4 e escolha uma imagem empilhada acima. Em seguida, feche a janela calibration_GUI. Ele gerará automaticamente um mapa de peso para compensar a intensidade desequilibrada em cada ponto.
   NOTA: Para uma descrição mais detalhada, o código MATLAB pode ser baixado aqui (https://github.com/ZenKG/SLM_control).

4. Imagem de Ca²⁺ usando um sensor de imagem com iluminação holográfica (Figura 3)

1. Coloque o mouse injetado com AAV com uma placa de cabeça sob o microscópio (Figura 1D).
   NOTA: Durante este procedimento, o mouse é contido no estado acordado, mas é capaz de escapar de estímulos desconfortáveis.
2. Execute imagens de dois fótons (modo de varredura de ponto) usando um microscópio holográfico e um laser de Ti: safira com bloqueio de modo sintonizado para 920 nm com uma objetiva de 25x (consulte a Tabela de Materiais).
3. Ligue o software de imagem comercial (consulte Tabela de materiais). No modo de imagem ao vivo, ajuste a voltagem do detector de imagem (consulte a Tabela de Materiais) e a potência do laser de imagem para otimizar o brilho dos neurônios que expressam jGCaMP8f. Capture imagens dos neurônios que expressam essa proteína.
   NOTA: A intensidade do laser de imagem (920 nm) é de 20-30 mW. O FOV foi de 512 μm × 512 μm a uma profundidade de 100-150 μm da superfície cortical.
4. Para iluminar neurônios específicos que expressam jGCaMP8f com iluminação holográfica, execute o arquivo de script SLMcontrol.m. Clique na imagem de referência e escolha a imagem adquirida acima. Em seguida, clique no botão Spot para escolher pixels específicos nos neurônios na imagem clicando continuamente com o mouse (Figura 3A). Se a seleção estiver concluída, pressione o botão Enter no teclado para finalizá-la.
   NOTA: O holograma digital é calculado automaticamente e exibido no modulador de luz espacial (SLM). Esse padrão também pode ser revisitado clicando em uma caixa de listagem. A resolução espacial de um único ponto gerado pelo SLM foi de aproximadamente 1,2 μm ao longo da direção transversal e ~ 8,3 μm ao longo do eixo óptico. Usamos uma lente objetiva de alta abertura numérica (1,1) para obter uma estimulação holográfica mais localizada.
5. Para detectar atividade neural com alta resolução temporal usando um sensor de imagem (consulte a Tabela de Materiais), defina o tempo de exposição, a área de imagem e o binning (Figura 3B) antes de realizar a aquisição da imagem (Figura 3C).
   NOTA: A intensidade do laser de iluminação holográfica (920 nm) que estimula continuamente um neurônio é de 2 mW, o que é suficiente para detectar a atividade neural. Por exemplo, para atingir uma taxa de quadros de 100 Hz para imagens, o tempo de exposição é de 9 ms, a área de imagem é de 400 μm × 400 μm e o binning é 4.
6. Após o experimento, retorne o mouse à sua gaiola inicial.

5. Imagem de dois fótons (modo de varredura pontual) com optogenética usando um microscópio holográfico (Figura 4)

1. Repita as etapas 4.1 e 4.2.
2. Ligue o software de imagem comercial (consulte Tabela de materiais). No modo de imagem ao vivo, ajuste a voltagem do detector de imagem (consulte a Tabela de Materiais) e a potência do laser de imagem para otimizar o brilho dos neurônios que expressam GCaMP6m-P2A-ChRmine. Capture imagens dos neurônios que expressam essas proteínas (Figura 1E).
3. Repita a etapa 4.4.
4. Para investigar a conectividade funcional dentro dos neurônios L2/3, use um SLM para gerar padrões holográficos de estimulação optogenética (ChRmine; 1.040 nm) e combine-o com imagens de Ca²⁺ de dois fótons (GCaMP6m; 920 nm, 512 × 512 pixels, 2 Hz ou 30 Hz, zoom digital de 2x, modo de varredura de ponto; Figura 3D-H).
   1. Para este protocolo, defina a intensidade do laser de imagem para 920 nm, a 10-20 mW, e o FOV como 256 μm × 256 μm medido a uma profundidade de 100-150 μm da superfície cortical. Defina o tempo de permanência do pixel em 1.5 μs para 2 Hz ou 100 ns para 30 Hz.
   2. Para ver se um único estímulo holográfico causou uma resposta de cálcio nos neurônios, use 2 Hz e 30 Hz como taxa de quadros de imagem. Defina a intensidade do laser de estimulação holográfica (1.040 nm) que estimula um único neurônio a 10 mW, o que é suficiente para induzir a atividade neural (Figura 3D).
      NOTA: A resolução espacial de um único ponto gerado pelo SLM é de aproximadamente 1,2 μm ao longo da direção transversal e ~8,3 μm ao longo do eixo óptico. A faixa de volume acessível na direção lateral é de cerca de 500 μm × 500 μm e 100 μm na direção axial. Confirmamos ainda com imagens de Ca²⁺ na taxa de quadros de imagens de 2 Hz ou 30 Hz que não apenas um neurônio, mas vários neurônios podem ser estimulados holograficamente simultaneamente (Figura 3E).
5. Realize a aquisição de imagens com o seguinte protocolo: imagem simultânea da resposta de Ca²⁺ a 920 nm com 10 estímulos holográficos a 1.040 nm com intervalos de 8 s (0,125 Hz) por uma duração de 50 ms após um período de linha de base de 10 s.

Resultados

Figura 1: Esquema do procedimento experimental. (A) Fixação da placa da cabeça ao crânio. (B) Injeção estereotáxica de AAV na área da pata traseira do córtex somatossensorial primário (S1HL). (C) Implan...

Materiais