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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Configuração do microscópio para imagens com lapso de tempo
1. Determinando as configurações do laser
1. Determinando o comprimento de onda do laser a ser usado. Use um comprimento de onda que seja o dobro do comprimento de onda de excitação do fluoróforo de interesse (por exemplo, comprimento de onda entre 880 e 940 nm para proteína fluorescente verde (GFP).
NOTA: No presente estudo, a configuração do comprimento de onda para GFP estava entre 880 e 940 nm. Quanto maior o comprimento de onda, menor a potência de saída do laser.
2. Determine a transmissão do laser. Uma alta porcentagem de transmissão a laser matará o embrião, use o nível mais baixo de transmissão (recomendado). Para estudos de lapso de tempo de 24 a 48 h, como aqui apresentados, mantenha a transmissão abaixo de 5%.
3. Determine os sistemas de detecção de microscópio e certifique-se de que os filtros corretos para o fluoróforo estejam instalados.
NOTA: Para microscópios multifótons, existem vários sistemas de detecção com várias sensibilidades para a fluorescência emitida. Em geral, um sistema de detecção interno tem menos sensibilidade do que um sistema de detecção externo. Para linhagens transgênicas com altos níveis de expressão de GFP, o sistema de detecção interna é adequado. Para linhas transgênicas com baixos níveis de expressão de GFP ou com outros fluoróforos (por exemplo, proteína fluorescente vermelha), um sistema de detecção externo pode ser necessário para manter a porcentagem de transmissão do laser em um nível razoável. Independentemente do sistema de detecção usado, os filtros corretos para o fluoróforo devem estar instalados.
2. Ajustando as configurações de software no microscópio multifóton
1. Usando a objetiva 5X, localize o embrião. Eleve manualmente a platina para a posição mais alta e use o foco fino para posicionar o embrião no meio da faixa do microscópio.
2. Abaixe manualmente o stage e altere a objetiva de 5X para a objetiva de imersão em água de 25X (abertura numérica NA, 0,95). Levante cuidadosamente o palco para trazer o embrião de volta ao foco.
3. No software, clique no modo "xyzt" para obter várias imagens em intervalos de tempo (t) no plano x-y sobre uma profundidade de "z". Use a visualização de epifluorescência ou campo claro para encontrar a profundidade de foco na área de interesse, que demarcará a pilha Z.
1. No software, clique no botão "iniciar"; para esses experimentos, a borda lateral do olho foi o início da pilha Z. Clique no botão "final"; a linha média do embrião era o final da pilha Z.
NOTA: O tamanho do passo era de 0,3-0,6 μm e havia um total de ~ 200 passos para um tamanho de pilha z de 60 a 120 μm).
4. Clique no menu para ajustar o tempo de aquisição e a frequência de imagem.
Para o sistema atual, ~200 etapas requerem aproximadamente 5 min para cada aquisição de z-stack. Para uma recuperação adequada do fluoróforo e sobrevivência do embrião, permita uma proporção de pelo menos 1:3 entre a aquisição da pilha z (ativação do laser) e o tempo de recuperação (desligamento do laser).
NOTA: Por exemplo, as pilhas z são adquiridas a cada 20 minutos com 5 minutos de aquisição da pilha z e 15 minutos de recuperação. Para este protocolo, z-stacks maiores podem ser obtidos, mas aumentariam adequadamente o tempo entre as aquisições de z-stack, resultando em menos imagens ao longo do curso de lapso de tempo.
1. Com o tempo apropriado para a recuperação do embrião, defina o tempo entre as pilhas z na janela designada. Defina o período total de tempo para o experimento na janela apropriada.
5. Ajustes finais de software, laser e embrião.
1. Ative a configuração de imagem ao vivo para fazer os ajustes finais nas configurações do laser. Ajuste as barras deslizantes de transmissão, ganho e deslocamento do laser no software para otimizar a imagem fluorescente. Além disso, ajuste a orientação do embrião, conforme necessário, dependendo da duração do experimento, crescimento antecipado do embrião, etc. Certifique-se de que a área de interesse permaneça dentro do quadro durante o experimento.
2. Desligue a fonte de luz epifluorescente, pois ela não é mais necessária durante a aquisição de lapso de tempo. Cubra o palco com a caixa de segurança do laser (Figura 1I). Ao usar o sistema de detecção interno, a caixa de segurança do laser é adequada para proteção contra a luz de fundo. Pressione "start".
NOTA: No entanto, com sistemas de detecção externa mais sensíveis, a caixa de segurança do laser não bloqueia luz de fundo suficiente e tampas adicionais são necessárias para evitar a interrupção da aquisição da imagem.
2. Durante a aquisição de lapso de tempo
1. Reabasteça a câmara de banho aberta com meio embrionário de lapso de tempo a cada 8-12 h (pelo menos 2 vezes por dia) durante a aquisição de lapso de tempo através das portas deslizantes na caixa de segurança do laser (Figura 1I).
2. Antes de abrir as portas da caixa de segurança do laser, certifique-se de que o microscópio não esteja adquirindo uma imagem ativamente.
NOTA: O uso de aquecedores e sistemas de circulação de meios não é necessário para experimentos de imagem com lapso de tempo com duração de 24 a 48 h. De fato, as temperaturas dos aquecedores em linha e em linha são difíceis de controlar e, durante a aquisição da imagem, o embrião exibe uma taxa de desenvolvimento adequada em uma faixa de temperatura de 25 a 28 ° C. Além disso, os sistemas de meios circulantes tendem a transbordar e potencialmente danificar o equipamento. Assim, todos os embriões são rotineiramente estadiados após a aquisição.
3. Processamento pós-aquisição
1. No software, clique no menu "arquivo" e escolha "salvar".
2. Abra o arquivo no software de processamento de imagem (consulte a Tabela de Materiais). Realce a série de imagens correta. No software, escolha o menu "Processo". Clique em Deconvolução 3D e em "Aplicar" para desconvoluir cada z-stack.
NOTA: O arquivo é grande; portanto, esta etapa pode levar muitas horas.
3. No software, no menu "Processo", clique em "projeção máxima". Clique em "Aplicar" para iniciar a projeção máxima para gerar 1 imagem por pilha z. Exporte cada arquivo máximo projetado (1 imagem por pilha z) como um tiff.
4. Importe arquivos tiff individuais para o software de processamento de vídeo. Selecione todos os arquivos tiff e arraste-os para o editor de vídeo. Ajuste a duração de cada imagem no vídeo para 0,1 s. Exporte o vídeo como arquivo mov ou mp4.
