Visualização de padrões de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila

1. Preparação

1. Prepare 500 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com solução de t-octilfenoxipolietoxietanol (PBT) adicionando 0,5 g de albumina de soro bovino (BSA) e 0,5 mL de t-octilfenoxipolietoxietanol (consulte a Tabela de Materiais) a 500 mL de PBS 1X e mexendo por pelo menos 30 min. Armazene a 4 ° C. Use quando estiver relativamente fresco e armazene a solução em um frasco limpo.
2. Faça 10 mL de paraformaldeído a 4% adicionando 2,5 mL de solução de paraformaldeído a 16% e 1 mL de PBS 10x a 6,5 mL de água deionizada. Armazene a 4 °C e use dentro de uma semana.
   CUIDADO: Evite o contato da pele com a solução de paraformaldeído, pois é altamente tóxica.
3. Faça o substrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo (X-Gal) (10% p / v X-Gal em dimetilsulfóxido (DMSO)) dissolvendo 0,1 g de substrato X-Gal por 1 mL de DMSO. Armazenar a -20 °C em alíquotas de 100 μL.
4. Faça a solução de coloração X-Gal usando tampão fosfato 10 mM (pH 7,2), cloreto de sódio 150 mM, NaCl, cloreto de magnésio 1 mM, MgCl₂, ferrocianeto de potássio 3 mM, K₄ [FeII (CN) ₆], ferricianeto de potássio 3 mM, K₃ [FeIII (CN) ₆] e 0,3% de t-octilfenoxipolietoxietanol. Conservar a 4 °C no escuro.
5. Faça uma solução de peróxido de hidrogênio a 3% diluindo o estoque de peróxido de hidrogênio a 30% 1:10 com água deionizada.
6. Faça a solução de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) dissolvendo completamente 1 comprimido (10 mg) de DAB em 35 mL de solução fresca de PBT. Filtre através de um filtro de seringa de 0,2 μm e armazene a -20 °C em alíquotas de 910 μL.
   CUIDADO: Descarte todos os resíduos de DAB em alvejante para destruir o DAB.
7. Faça pratos de ovo com suco de maçã. Adicionar 35 g de ágar e 1 l de água desionizada a um balão de 2 L. Adicione 33 g de sacarose, 2 g de tegosept e 375 mL de suco de maçã em um frasco de 1 L. Derreta-os em autoclave por 30 min. Deixar arrefecer ambas as soluções até cerca de 60 °C. Misturar bem estas soluções agitando. Despeje ~ 11 mL da solução combinada por placa de cultura de 60 mm.
8. Faça pasta de fermento misturando fermento de padeiro em água deionizada (proporção de 1:0,8) e armazene a 4 °C.

2. Coleta de embriões (dia 1)

1. Colete moscas fêmeas e machos jovens (com menos de 5 dias) e, por 1-2 dias, mantenha-as em uma gaiola de copo de plástico com uma placa de ovo (60 mm x 15 mm) que contenha uma pequena quantidade de pasta de fermento no centro.
2. Para a coleta ideal de embriões em estágio avançado de 16, monte uma gaiola de garrafa com moscas (> 50) por volta das 17h e deixe-as botar ovos a 25 ° C por 3 h.
3. Transfira as moscas para uma garrafa de comida fresca.
4. Feche a placa de ovo com a tampa e incube-a de cabeça para baixo a 25 °C em uma incubadora umidificada (~ 70% de umidade) durante a noite.

3. Preparação de embriões para imunocoloração (Dia 2)

1. Adicione 1,8 mL de solução de PBT à placa de ovos por volta das 10h20 e use um cotonete para soltar os embriões da placa enquanto a inclina.
   NOTA: Esmagando suavemente a pasta de fermento usando um cotonete, dissolva-a caso um grande número de embriões seja encontrado nela. Comece a coletar os embriões ~ 40 minutos antes da fixação (por volta das 11:00 da manhã).
2. Transfira os embriões da placa de ovo para um microtubo de 1,5 mL usando uma ponta de pipeta de 1 mL.
3. Permitir que os embriões se acalmem e aspirar a solução de PBT tanto quanto possível. Enxágue os embriões duas vezes com 1 mL de solução PBT. Aspire a solução PBT o máximo possível.
4. Encha o tubo com 1 mL de água sanitária a 50% (ou seja, diluído em água deionizada) e descorione os embriões incubando-os em um nutador por 3 min em temperatura ambiente (TR).
   NOTA: Esta etapa não mata os embriões descorionados.
5. Deixe os embriões descorionados se assentarem, aspire o alvejante a 50% o máximo possível e enxágue os embriões 3 vezes com 1 mL de solução de PBT.
6. Adicione 0,5 mL de heptano e, posteriormente, adicione 0,5 mL de solução de paraformaldeído a 4% ao tubo em RT por volta das 11:00 AM.
7. Incubar os embriões em um nutator por 15 min em RT.
8. Remova a solução de paraformaldeído a 4% (a camada inferior).
9. Adicionar 0,5 mL de metanol a 100% e desvitelistar os embriões agitando vigorosamente o tubo por 30 s.
10. Remova o heptano (ou seja, a camada superior).
11. Adicione 0,5 mL de metanol a 100% e agite o tubo vigorosamente por 10 s.
12. Deixe os embriões se estabelecerem batendo no tubo e aspire o metanol o máximo possível. Enxágue os embriões com 1 mL de metanol 100%, agitando por menos de 10 s.
    NOTA: A exposição prolongada ao metanol destrói a atividade de β-Gal.
13. Remova o metanol e enxágue os embriões desvitelinos 3 vezes com 1 mL de solução PBT.

4. Genotipagem dos embriões usando coloração LacZ (Dia 2)

1. Adicione 1 mL de solução PBT ao tubo e incube o tubo em um bloco de calor a 37 °C ou banho-maria por 15 min.
2. Durante a incubação, coloque a solução de coloração X-Gal (1 mL por tubo) a 65 ° C em banho-maria até que fique turva. Incube-o em banho-maria a 37 °C.
3. Aspire a solução PBT e adicione 1 mL de solução de coloração X-Gal e 20 μL de substrato X-Gal ao tubo.
4. Incubar o tubo a 37 °C com nutação até que um precipitado azul seja evidente.
   NOTA: O tempo de incubação para o 2º e 3º balanceadores azuis em geral varia de 2-4 h.
5. Remova a solução de coloração X-Gal e enxágue os embriões 3 vezes com 1 mL de solução RT PBT.
6. Usando uma sonda de agulha ou fórceps, classifique manualmente os embriões do genótipo desejado (ou seja, embriões brancos não corados) com um microscópio de dissecação de luz (objetivas de 1,6X-2,5X).
   NOTA: Como alguns balanceadores azuis, como CyO, actina-LacZ e TM3, actina-LacZ, carregam uma construção transgênica expressando β-Gal bacteriana (LacZ) sob o controle da actina promotor, os embriões corados de azul de maneira onipresente contêm uma ou duas cópias de cromossomos balanceadores azuis. Portanto, embriões brancos não corados são homozigotos para o alelo letal desejado.

5. Imunocoloração de embriões com anticorpos antifasciclina II (dia 2-3)

1. Colete e transfira os embriões do genótipo desejado (ou seja, embriões brancos não corados) para um microtubo de 0,5 mL usando uma ponta de pipeta de 1 mL.
   NOTA: Nesta etapa, os embriões podem ser aproximadamente estadiados de acordo com critérios morfológicos, incluindo os padrões de segmentação da cutícula e as estruturas da cabeça e cauda. Durante a involução da cabeça, entre 10 e 16 h após a postura dos ovos, o embrião sofre uma redução pronunciada do segmento anterior.
2. Lave os embriões uma vez com 0,4 mL de solução de PBT e adicione 0,3 mL de solução de bloqueio (5% de soro de cabra normal e 5% de DMSO em solução de PBT).
3. Bloqueie os embriões com nutação em RT por 15 min.
4. Adicione 75 μL de anticorpo anti-Fasciclin II e incube o tubo com nutação em RT durante a noite.
5. Lave os embriões 4 vezes com 0,4 mL de solução PBT por pelo menos 20 min por lavagem.
6. Adicione 0,3 mL de solução de bloqueio (soro de cabra normal a 5% em solução PBT) contendo anticorpo anti-peroxidase de raiz-forte de camundongo (anti-HRP de camundongo) (2 μg / mL) e incube o tubo com nutação em RT durante a noite.
7. Lave os embriões 6 vezes com 0,4 mL de solução PBT por pelo menos 20 min por lavagem.
8. Adicione 0,3 mL de solução DAB ao tubo.
   CUIDADO: Use luvas e coloque todos os resíduos/tubos/pontas DAB em alvejante.
9. Adicione 2 μL de peróxido de hidrogênio a 3% e incube o tubo no escuro com nutação em RT até que a quantidade desejada de precipitado seja produzida.
   NOTA: O tempo de incubação para imuno-histoquímica 1D4 em geral varia de 0,5-1 h.
10. Lavar os embriões 4 vezes com 0,4 mL de solução de PBT.
    CUIDADO: Retirar a solução de DAB e as duas primeiras lavagens com pipeta e descartar em água sanitária.
11. Adicione 0,2 mL de solução de glicerol / PBS a 70% de montagem ao tubo e armazene em RT ou 4 ° C.
    NOTA: Mantenha o tubo longe da luz. Preparações mais claras podem ser obtidas colocando os embriões em uma solução de glicerol / PBS a 90%. No entanto, é mais difícil dissecar embriões depurados em solução de glicerol / PBS a 90% do que aqueles eliminados em solução de glicerol / PBS a 70%.

6. Estadiamento, dissecação, montagem e imagem dos embriões (dia 4)

1. Para o estadiamento, transfira os embriões equilibrados com glicerol / PBS a 70% para uma lâmina de vidro.
2. Colete embriões em estágio avançado 16 que tenham nervos dos nervos intersegmentares (ISN) do segmento abdominal 7 (A7), A8 e A9 convergindo para se tocar e/ou tenham intestino médio subdividido em três bandas.
   NOTA: Os embriões corados com anticorpo 1D4 podem ser estadiados com base nos padrões de projeção dos axônios motores ISN e ISNb. Depois de sair do sistema nervoso central (SNC), os nervos ISN A7, A8 e A9 dos embriões do estágio 16 final convergem para se tocar e, posteriormente, divergem para se estender até os músculos dorsais (ponta de seta na Figura 1A). Em embriões de estágio intermediário 16, no entanto, os nervos ISN A7 se estendem em paralelo com os nervos A8 / A9 (colchete na Figura 1B). Além disso, os eixos de projeção dos nervos A6 ISNb (perpendiculares aos músculos ventrolaterais) em ambos os hemissegmentos estão aproximadamente alinhados com a extremidade posterior dos fascículos axônicos longitudinais do SNC (setas e uma linha na Figura 1C). Esses critérios morfológicos variam entre os diferentes genótipos. Alternativamente, os embriões podem ser estadiados com base na morfologia intestinal. Antes do estágio 17, o intestino médio tem uma forma semelhante a um coração, enquanto o intestino médio é subdividido em três bandas no estágio 17.
3. Dissecar os embriões.
   1. Usando uma seringa de 1 mL, mova cada embrião para fora da gota de glicerol e coloque o embrião com a face ventral para cima. Corte a parte anterior em 1/4 do comprimento do corpo e a região mais posterior que está livre de axônios motores.
   2. Usando uma sonda de agulha, mova o embrião cortado para fora da gota de glicerol, role-o para orientá-lo com o lado dorsal para cima e coloque-o horizontalmente no campo.
      NOTA: Quando o embrião é movido para fora da gota de glicerol, um pouco de glicerol associado ao embrião o torna pegajoso.
   3. Corte o embrião ao longo da linha média dorsal usando uma única agulha de tungstênio muito fina. Faça um pequeno corte na extremidade posterior do embrião e continue a cortar a linha média dorsal em direção à anterior; Cortar na direção oposta também é bom.
   4. Usando uma sonda de agulha, mova o embrião cortado na linha média para a gota de glicerol, coloque-o com o lado dorsal para cima e separe o intestino da parede do corpo desdobrando cada parede do corpo na direção ventrolateral (diagonal) (objetiva de 2,5X).
      NOTA: Certifique-se de que a linha média dorsal esteja totalmente cortada, resultando na separação completa entre as paredes esquerda e direita do corpo.
   5. Mova cuidadosamente o embrião cortado na linha média para fora da gota de glicerol e, em seguida, coloque duas abas da parede do corpo na lâmina de vidro usando uma sonda de agulha fina (objetiva de 2,5X).
   6. Usando uma agulha de tungstênio muito fina, remova os órgãos internos do embrião dissecado empurrando-os lateralmente (objetiva 5X).
      NOTA: Uma descrição mais detalhada de outro procedimento de dissecção semelhante pode ser encontrada no site.
4. Para a montagem, adicione 2-3 μL de solução de glicerol / PBS a 70% para limpar os embriões dissecados e, usando uma sonda de agulha fina, transfira-os para uma nova lâmina de vidro na qual 8 μL de solução de glicerol / PBS a 70% foram espalhados no centro (objetiva 2,5X).
5. Coloque uma lamínula (18 mm x 18 mm). Sele as bordas da lamínula com esmalte comum (transparente ou colorido é bom).
6. Capture imagens em alta resolução (objetivas de imersão em óleo de 20X, 40X e 63X) sob um microscópio óptico de contraste de interferência diferencial (DIC), de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: Melhor visualização e caracterização fenotípica, especialmente para axônios motores ISNb, podem ser produzidas usando uma objetiva de imersão em óleo de 63X.

Figura 1: Estadiamento de embriões com base nos padrões de projeção dos axônios motores ISN e ISNb. (A) Em embriões selvagens em estágio final 16, os nervos ISN A7, A8 e A9 (setas) convergem para se tocar (ponta de seta). Anterior é esquerdo e ventral é baixo. A barra de escala = 15 μm. (B) Em embriões selvagens de estágio intermediário 16, o nervo ISN A7 se estende em paralelo com os nervos A8 / A9 (colchete). As setas indicam os nervos ISN A7, A8 e A9. Anterior é esquerdo e ventral é baixo. A barra de escala = 15 μm. (C) Preparação filetada de embriões de tipo selvagem em estágio 16 tardio corados com anticorpo FasII. Os eixos de projeção (setas) dos nervos A6 ISNb esquerdo e direito estão aproximadamente alinhados com a extremidade posterior dos fascículos axônicos longitudinais do SNC (linha preta). Os segmentos abdominais A1-A7 são rotulados na parte superior. Anterior é à esquerda. A barra de escala = 15 μm.