Imagem in vivo do cérebro larval de peixe-zebra para visualização de neurônios cerebelares

Resumo

Fonte: Schramm, P. et al. Imagem in vivo de tecido cerebral totalmente ativo em larvas e juvenis de peixe-zebra acordados por remoção de crânio e pele. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a imagem in vivo de neurônios cerebelares em larvas transgênicas de peixe-zebra, que expressam proteínas fluorescentes em neurônios de Purkinje. O processo envolve anestesiar as larvas, imobilizá-las em agarose e remover cuidadosamente a pele pigmentada para aumentar a penetração da luz e a intensidade da fluorescência. Finalmente, os espécimes preparados são fotografados sob um microscópio confocal para visualizar claramente os neurônios marcados.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Anestesia de larvas e preparações para incorporação
   1. Ao iniciar o experimento do dia, transfira os animais necessários com uma pipeta de plástico Pasteur para uma placa de Petri de 90 mm de diâmetro, que é preenchida com Danieau (para larvas que ainda são mantidas em uma placa de Petri com Danieau) ou água da instalação de peixes (para larvas com mais de 7 dias após a fertilização [dpf] e são mantidas nas instalações de pesca).
      1. Ao pipetar peixes com mais de 2 semanas, certifique-se de que a abertura da pipeta seja grande o suficiente para evitar ferir os peixes ao transferi-los. Não use uma rede, pois isso danificará fisicamente os peixes, especialmente as larvas mais jovens.
   2. Adicione rotíferos ou náuplios de artemia adequados ao tamanho das larvas mantidas na placa de Petri para garantir o livre acesso aos alimentos e o máximo estado de saúde das larvas e reduzir o estresse.
   3. Para incorporação, transfira as larvas selecionadas para uma placa de Petri de 35 mm de diâmetro cheia de líquido cefalorraquidiano artificial (ACSF). Adicione o volume necessário de d-Tubocurarina para atingir uma concentração de trabalho/dose efetiva de 10 μM e aguarde alguns minutos até que as larvas estejam completamente imobilizadas.
      NOTA: Quando os peixes envelhecem ou se for necessária uma anestesia completa mais rápida (menos de 5 min), é possível aumentar a concentração de d-Tubocurarina (LD50 para camundongos é de 0,13 mg/kg por via intravenosa). Também é possível usar um anestésico diferente, como a α-bungarotoxina (concentração de trabalho: 1 mg/mL), que tem o mesmo efeito do curare e também mantém o cérebro totalmente ativo. Se um cérebro totalmente ativo não for necessário para o assunto de interesse, a tricaína em dose não letal (0,02%) também é uma opção para anestesiar totalmente as larvas. No entanto, a tricaína bloqueia os canais de sódio, prejudicando assim a atividade cerebral.
   4. Prepare a câmara de montagem pegando a tampa da placa de Petri de 35 mm de diâmetro, vire a tampa de cabeça para baixo e coloque uma lamínula de vidro quadrada (24 x 24 mm) na parte inferior da tampa. Consulte a Figura 1 (parte superior) para obter uma descrição esquemática dessas etapas. A superfície mais lisa do vidro evita o deslizamento do bloco de agarose, que contém as larvas durante o procedimento de abertura do crânio.
   5. Aliquotar a quantidade de ACSF necessária para o dia em um frasco apropriado (por exemplo, tubo de 50 mL, copo, frasco Schott, etc.) e oxigená-lo com carbogênio (5% CO₂, 95% O₂). Se a imagem apenas da morfologia (por exemplo, padrões de fluorescência), o ACSF ainda é necessário para garantir a integridade do cérebro e que as células não sejam influenciadas negativamente pelos efeitos da osmolaridade, mas a oxigenação do ACSF não é necessária. Esta etapa só precisa ser realizada quando a atividade cerebral total for necessária para a geração de imagens.
      NOTA: Para uma saturação ideal de oxigênio do meio, adicione uma pedra de ar na extremidade do tubo de carbônio. Para garantir um nível de oxigênio suficientemente alto, é necessário trocar o ACSF nas câmaras de imagem por ACSF recém-oxigenado a cada 20-60 min, dependendo do número e da idade das larvas embutidas na mesma câmara de imagem (por exemplo, para uma única larva incorporada, a troca de ACSF a cada hora é suficiente. Para seis larvas com mais de 14 dpf embutidas em paralelo, é necessária a troca de ACSF a cada 20 min), portanto, planeje a quantidade necessária de ACSF saturado de oxigênio de acordo com o experimento planejado.
2. Incorporação das larvas
   1. Transfira as larvas totalmente anestesiadas com uma pipeta de plástico Pasteur para a câmara de montagem preparada (na etapa 1.4). Em seguida, remova cuidadosamente o excesso de meio para evitar a diluição da agarose de baixo ponto de fusão (LM). Todas as etapas a seguir devem ser executadas sob um microscópio estéreo com ampliação suficiente.
      NOTA: Inclinar a câmara de montagem pode ajudar a remover totalmente o meio.
   2. Prossiga imediatamente para a próxima etapa, adicionando uma gota de LM-agarose suficientemente grande em cima das larvas (cerca de 1 mL, dependendo do tamanho das larvas) para proteger os animais do ressecamento e reduzir o estresse desnecessário.
   3. Oriente as larvas na posição antes que a agarose se solidifique. Certifique-se de que a parte dorsal das larvas esteja direcionada para cima. Além disso, certifique-se de incorporar as larvas o mais próximo possível da superfície da agarose.
      NOTA: Dependendo do tamanho e do número de larvas planejadas para serem incorporadas ao mesmo tempo, é possível ajustar a concentração de agarose. Por exemplo, para 1-3 larvas com 30 dpf de idade, recomenda-se uma concentração de 1,8% -2% de LM-agarose. Para 1-4 larvas com 7 dpf de idade, é mais praticável usar 2,5% de agarose LM, enquanto para 5-8 larvas, 2% é mais adequado. Se for necessário um cérebro totalmente ativo, recomenda-se incorporar apenas três peixes ao mesmo tempo para reduzir o tempo necessário para operar as larvas. Em geral, recomenda-se o uso de concentrações mais baixas (1,8%-2%) quanto mais velhas as larvas ficam ou quanto mais larvas são planejadas para serem incorporadas ao mesmo tempo.
   4. Se as imagens forem gravadas usando um microscópio invertido, corte o bloco de agarose contendo as larvas em uma pequena forma cubóide. Isso é importante para transferir as larvas para a câmara de imagem posteriormente. Se estiver usando um microscópio vertical, esse corte não é necessário, porque a câmara de montagem também pode ser usada como câmara de imagem. Na Figura 1 (parte superior), pode-se encontrar uma descrição esquemática dessas etapas.
3. Expondo o cérebro
   NOTA: Todas as etapas a seguir devem ser executadas com o maior cuidado para não ferir desnecessariamente as larvas. Se um cérebro totalmente ativo for necessário para o experimento, lembre-se de que, a cada segundo que passa, enquanto o peixe ainda está totalmente montado em agarose e tem o crânio aberto sem ACSF oxigenado, o cérebro sofrerá com a falta de oxigênio e secará. Os efeitos da deficiência de oxigênio se tornarão ainda mais dramáticos quanto mais velhas forem as larvas incorporadas. Portanto, é importante realizar a cirurgia não apenas no menor tempo possível, mas também com a máxima precisão para evitar danos cerebrais mecânicos com a agulha. As etapas 3.2-3.4 não devem levar mais de 30 s por peixe quando treinadas.
4. Comece a cirurgia assim que a agarose estiver solidificada. Primeiro, corte todo o excesso de agarose acima da região do cérebro de interesse para obter livre acesso à cabeça e um espaço de trabalho claro. Se a parte dorsal da cabeça já estiver saindo da agarose, pule esta etapa.
5. Dependendo da região de interesse, escolha um local para começar a cirurgia. Pegue a agulha de vidro e faça uma pequena incisão na pele sem penetrar muito profundamente no tecido. Este será o ponto de partida para descascar a pele sobreposta.
   NOTA: Para obter os melhores resultados, nunca comece diretamente acima da região de interesse para reduzir o risco de danificar estruturas importantes. Se necessário, é possível começar posteriormente ao rombencéfalo e avançar até que a área indesejada da pele seja removida.
6. Continue com cortes muito pequenos ao longo da parte da pele, com o objetivo de removê-la apenas movendo a agulha logo abaixo da superfície. Na maioria das vezes, não é necessário mover-se completamente ao redor do cérebro e cortar um pedaço de pele e crânio em forma de círculo, mas apenas fazer duas incisões ao longo da cabeça e depois empurrar a pele para um ou outro lado. A Figura 2 mostra uma representação esquemática da estratégia de corte ideal para obter acesso livre ao cerebelo.
   NOTA: Esta microcirurgia é um procedimento delicado e provavelmente precisará de algum treinamento para remover a pele perfeitamente sem danificar o cérebro subjacente. Também é recomendável encontrar a estratégia de corte ideal para a região do cérebro de interesse e mantê-la durante o experimento.
7. Imediatamente após remover a pele de todas as larvas incorporadas, despeje ACSF (oxigenado) sobre a agarose para remover partículas indesejadas da pele e sangue, manter o cérebro totalmente ativo e protegê-lo de secar.
   NOTA: Se um cérebro saudável for necessário para o experimento, é recomendável ir para um máximo de três peixes por vez.
8. Se estiver usando um microscópio vertical, comece diretamente com a imagem.
   1. Ao usar um microscópio invertido, deslize uma pequena espátula por baixo do bloco de agarose cubóide (etapa 2.4).
   2. Adicione uma pequena gota de LM-agarose no fundo da câmara de imagem (por exemplo, prato com fundo de vidro) e vire imediatamente o bloco de agarose contendo as larvas com a espátula por 180 ° e empurre-o suavemente para o fundo da câmara de imagem, enquanto a gota de agarose líquida atua como cola.
   3. Quando a agarose estiver solidificada, encha a câmara de imagem com ACSF (oxigenado) e comece a obter imagens. Consulte a Figura 1 (parte inferior) para obter uma descrição esquemática.
9. Quando a atividade cerebral total for necessária para o experimento, certifique-se sempre de que o ACSF na câmara de imagem tenha um nível de oxigênio suficientemente alto. Para garantir isso, o meio deve ser trocado cuidadosamente com ACSF recém-oxigenado a cada 20-60 minutos (dependendo do número e tamanho do peixe, do tamanho e da superfície da câmara de imagem e da duração da imagem).

Resultados

Figura 1: Procedimento esquemático para a preparação de peixe-zebra de crânio aberto para imagens in vivo de maneira gradual. As instruções de trabalho para as diferentes etapas podem ser encontradas...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscópio confocal de varredura a laser	Leica	TCS SP8
d-Tubocurare	Sigma-Aldrich	T2379-100MG
Glass Capillary type 1	WPI	1B150F-4
Capilar de vidro tipo 2	Harvard Apparatus	GC100F-10
Glass Coverslip	deltalab	D102424
Câmara de imagem	Ibidi	81156
LM-Agarose	Condalab	8050.55
Câmera de microscópio	Leica	DFC9000 GTC
Extrator de agulhas tipo 1	NARISHIGE	Modelo PC-10
Extrator de agulhas tipo 2	Sutter Instruments	Modelo P-2000
Pasteur-Pipetas 3ml	A.Hartenstein	20170718
Tricain	Sigma-Aldrich	E10521-50G
Placa de Petri de 35 mm	Sarstedt	833900
Placa de Petri de 90 mm	Sarstedt	821473001