Caracterização das propriedades mecânicas do tecido cerebral de camundongos usando microscopia de força atômica

Resumo

Fonte: Canovic, E. P., et al. Caracterização de propriedades mecânicas multiescala do tecido cerebral usando microscopia de força atômica, recuo de impacto e reometria. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o uso da microscopia de força atômica (AFM) para medir as propriedades viscoelásticas do tecido cerebral, onde um cantilever com uma sonda esférica interage com o tecido e se dobra sob forças aplicadas. Um feixe de laser desviado para um detector rastreia o cantilever para medir a profundidade de indentação e o relaxamento da força, permitindo a caracterização das propriedades mecânicas do tecido.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Indentação habilitada para Microscópio de Força Atômica (AFM)

1. Prepare placas de Petri (P60) de 60 mm de diâmetro com um bioadesivo derivado de mexilhão de acordo com as instruções do fabricante.
   1. Prepare um estoque de solução tampão neutra consistindo de bicarbonato de sódio 0,1 M em água estéril com um pH ideal de 8,0. Filtre-esterilize (0,2 mícrons) o tampão de bicarbonato de sódio e armazene-o a 4 °C.
   2. Em uma capela de fluxo laminar, misture uma solução de 6,25% de bioadesivo derivado de mexilhão e 3,125% de hidróxido de sódio (NaOH) no tampão de bicarbonato de sódio.
   3. Pipetar 100 μl da solução bioadesiva para uma placa de Petri (P60) de 60 mm de diâmetro e utilizar uma ponta de pipeta para espalhar a solução num círculo de 3-5 cm de diâmetro.
   4. Deixe os pratos P60 descobertos em uma capela de fluxo laminar e deixe a solução secar (~ 30 min). Lave a louça 1x com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 2x com água estéril. Deixe a loiça secar ao ar numa coifa de fluxo laminar e guarde-a num saco de plástico selado a 4 °C durante um período máximo de 1 mês.
2. Calibre o AFM e estabeleça uma amostra do cérebro no AFM. nota: Siga as instruções de calibração do AFM de acordo com o fabricante.
   1. Carregue cuidadosamente uma sonda AFM com uma constante de mola nominal de 0,03 N/m e um cordão de borosilicato de 20 μm de diâmetro no suporte da sonda.
   2. Calibre a constante da mola e a sensibilidade ótica inversa da alavanca (InvOLS) do modilhão do AFM usando o método térmico do ajuste.
      NOTA: Uma vez que a constante da mola para uma ponta de prova do AFM é calculada, deve permanecer constante com uso repetido. No entanto, o cantilever InvOLS precisará ser recalibrado cada vez que o laser for realinhado com o cantilever. Além disso, a calibração deve ser realizada contra um substrato várias ordens de magnitude mais rígido que o cantilever, como o poliestireno.
   3. Ligue o aquecedor montado em stage e ajuste a temperatura para 37 °C.
   4. Monte a fatia do cérebro nas placas P60.
      1. Despeje suavemente uma fatia de cérebro de 350 μm de espessura e o meio independente de dióxido de carbono (CO₂) do frasco de fundo redondo em um prato P60 revestido com o bioadesivo derivado do mexilhão.
      2. Posicione a fatia de cérebro no centro do prato P60 inclinando-o suavemente. Se necessário, pipete lentamente o meio de uma pipeta manual para desdobrar uma fatia de cérebro que se dobrou sobre si mesma ou, melhor ainda, posicione a fatia de cérebro no centro do prato.
      3. Remova cuidadosamente o excesso de meio usando uma pipeta P1000 (não use o vácuo).
      4. Coloque uma tampa no prato P60 e deixe a fatia de cérebro aderir por 20 min.
   5. Remova a cabeça do AFM, coloque a fatia do cérebro montada no prato P60 no estágio do AFM e adicione ~ 2 ml de meio independente de CO₂ pré-aquecido.
   6. Adicione com cuidado uma gota dos meios na ponta de prova do AFM para protegê-la da quebra devido à tensão de superfície quando abaixada nos meios que cercam a fatia do cérebro.
   7. Reposicione a cabeça do AFM no palco e comece a abaixar a cabeça até que ela esteja submersa na mídia.
   8. Usando a câmera CCD (dispositivo de carga acoplada de vista superior), reposicione o laser no cantilever.
      NOTA: O alinhamento do laser no cantilever terá mudado ligeiramente devido à diferença no índice de refração do ar e do meio.
   9. Aguarde 5 minutos para que o cantilever se ajuste a ser submerso em um líquido quente e, em seguida, redefina o alinhamento do espelho para uma deflexão livre de 0 V.
   10. Execute um espectro térmico na ponta de prova do AFM de acordo com as instruções do fabricante. Use o ajuste do primeiro pico térmico para recalcular o InvOLS da sonda AFM nos meios.
   11. Usando o microscópio óptico, mova o estágio da amostra para que a região do cérebro de interesse fique abaixo da sonda AFM. nota: O corpo caloso parecerá escuro, pois é mais opaco do que a massa cinzenta circundante. O córtex é superior ao corpo caloso.
   12. Redefina o alinhamento do espelho para uma deflexão livre de 0 V.
   13. No medidor da soma e da deflexão no software do AFM, clique em "engate" para engatar a cabeça do AFM.
   14. Usando o seletor de posição na cabeça do AFM, abaixe a cabeça até que o contato seja feito entre o cantilever e a amostra.
3. Realize experimentos de conformidade de fluência.
   1. Construa uma função de força aplicada no editor de funções do software. A função de força consiste em uma rampa de 0,1 segundos para um ponto de ajuste de 5 nN e mantê-la por 20 segundos, seguida por uma rampa de 1 segundo até uma força aplicada de 0 nN.
      1. No Painel Mestre de Recuo, no método de recuo, selecione "Carregar" para Modo de Indentação, "N" para unidades e "Editor de Funções" para Função de Indentador.
      2. No editor de funções, no painel Segment Parms, crie um segmento de função de força aplicada que comece em 0 nN e termine em 5 nN, com um tempo de 0,1 seg. Clique em "Inserir -->".
      3. Para o próximo segmento, defina o início para 5 nN, o final para 5 nN e o tempo para 20 seg. Clique em "Inserir -->".
      4. Para o segmento final, defina o início como 5 nN, o final como 0 nN e o tempo como 1 seg. Em seguida, clique em "Desenhar" e feche a janela do Editor de Funções.
   2. Na guia Força do painel mestre, marque "indenter ramp após o disparo" e defina a função de força aplicada para disparar após atingir um ponto de disparo de 0.1 V.
   3. Clique em "Força única" na parte inferior da guia Força do painel mestre, que acionará a função de força aplicada construída para conformidade de fluência.
   4. Depois que o único recuo da força é terminado, levante a cabeça do AFM de modo que esteja fora do contato com a amostra. Em seguida, reengate a cabeça e zere novamente a deflexão livre.
   5. Reposicione o estágio de amostra para localizar uma nova área de interesse e abaixe a cabeça do AFM para fazer contato. nota: A cabeça do AFM deve ser retraída da superfície da amostra quando a fase da amostra é movida. Não fazer isso pode resultar em danos ao delicado balanço AFM.
   6. Repita as etapas até que a quantidade desejada de dados seja coletada.
4. Realize experimentos de relaxamento de força.
   1. Construa uma função de recuo aplicada no editor de funções do software. A função de recuo consiste em uma rampa de 0,1 segundos até um ponto de ajuste de 3 μm e mantê-la por 20 segundos, seguida por uma rampa de 1 segundo até uma profundidade de recuo de 0 μm.
      1. No Painel Mestre de Recuo, no método de recuo, selecione "Recuo" para o Modo de Indentação, "m" para unidades e "Editor de Funções" para Função de Indentador.
      2. No editor de funções, no painel Segment Parms, crie um segmento de função de força aplicada que comece em 0 μm e termine em 3 μm, com um tempo de 0,1 seg. Clique em "Inserir -->".
      3. Para o próximo segmento, defina o início para 3 μm, o final para 3 μm e o tempo para 20 seg. Clique em "Inserir -->".
      4. Para o segmento final, defina o início para 3 μm, o final para 0 μm e o tempo para 1 seg. Em seguida, clique em "Desenhar" e feche a janela do Editor de Funções.
   2. Na guia Força do painel mestre, marque "indenter ramp após o disparo" e defina a função de força aplicada para disparar após atingir um ponto de disparo de 0.1 V.
   3. Clique em "Força única" na parte inferior da guia Força do painel mestre para acionar a função de recuo aplicada construída para relaxamento de força.
   4. Depois que o recuo da único-força é terminado, levante a cabeça do AFM de modo que esteja fora do contato com a amostra, a seguir reengate a cabeça e re-zero a deflexão.
   5. Reposicione o palco para localizar uma nova área de interesse e abaixe a cabeça para fazer contato.
   6. Repita ambas as medições até que a quantidade desejada de dados tenha sido coletada.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Hibernate-A medium	Gibco	A1247501	CO2-meio neural independente para tecido adulto
Microscópio de força atômica, MFP-3D-BIO	Asylum Research	-
Aquecedor de placa de Petri	Asylum Research	-
Sonda AFM, 0,03 N/m, esfera de borossilicato de raio de 10 um	Novascan	PT. GS
Cell-Tak	Corning	354240	Bioadesivo derivado de mexilhão
Bicarbonato de sódio	Sigma-Aldrich	S5761	Fornecedores alternativos podem ser usados
Hidróxido de sódio, 1N	Sigma-Aldrich	59223C	Fornecedores alternativos podem ser usados