Indentação de impacto para avaliar as propriedades mecânicas de um tecido cerebral de camundongo

Resumo

Fonte: Canovic, E. P., et. al., Caracterização das propriedades mecânicas multiescala do tecido cerebral usando microscopia de força atômica, recuo de impacto e reometria. J. Vis. Exp. (2016)

O vídeo demonstra o uso de recuo de impacto para medir as propriedades mecânicas de um tecido cerebral de camundongo hidratado, incluindo rigidez, dissipação de energia e amortecimento, por meio do deslocamento da sonda e análise de velocidade.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Recuo de impacto
   1. Calibre o nanoindentador instrumentado e ajuste as configurações padrão para permitir experimentos de impacto dinâmico em tecidos cerebrais hidratados de acordo com as instruções do fabricante.
      1. Monte uma sonda esférica deslizando-a sobre o pêndulo usando uma pinça.
      2. Cole uma amostra de quartzo fundido no poste de amostra, que é aparafusado no estágio de translação.
      3. Vá para o menu Calibração e selecione "Célula Líquida". Siga as instruções do software para fazer contato com a amostra de quartzo fundido.
      4. Selecione "Normal" para o Tipo de penetrador e use o valor padrão de 0,05 mN para a Carga de penetração. Clique em "Continuar" para realizar a calibração para a configuração normal do penetrador.
      5. Recuar pelo menos 5 mm a etapa da amostra. Monte o braço da alavanca, que permite que a sonda seja abaixada na célula líquida, e repita a calibração da célula líquida na nova configuração selecionando "Célula Líquida" para o Tipo de Indentador. Clique em "Continuar" para obter o Fator de Calibração de Célula Líquida.
      6. Ative a opção de software Liquid Cell acessando o menu Experimento e selecionando "Opções especiais". Use o valor de calibração mais recente.
      7. Aumente o espaçamento da placa do capacitor, pois isso levará a uma maior profundidade máxima mensurável, o que é necessário ao testar materiais altamente compatíveis.
         1. No menu Sistema, selecione "Configurações não protegidas" e "Parâmetros da máquina" para alterar a taxa de carga de teste do pêndulo, a taxa de carga zero e o deslocamento da rampa de espera para 0.5 mN/s, 0.1 mN/s e 3 V, respectivamente.
         2. Com uma chave inglesa, gire as três porcas que controlam o espaçamento da placa do capacitor no sentido horário em pequenos incrementos.
         3. Após cada volta completa no sentido horário, selecione "Ajuste da caixa da ponte" no menu Manutenção e obtenha um bom teste de pêndulo, o que exigirá mover o peso do contrapeso para longe do pêndulo.
         4. Repita as etapas 1.1.7.2-1.1.7.3 até que a calibração de profundidade aproximada leia um valor de 70,000 nm/V ou superior.
      8. Posicione um novo batente de limite na parte inferior do pêndulo que pode ser ligado e desligado através de uma fonte de alimentação. Retraia o batente de limite original atrás do pêndulo para remover uma obstrução potencial do movimento do pêndulo e permitir velocidades de impacto mais altas, bem como profundidades de penetração mais altas em amostras compatíveis.
      9. Deixe o gabinete atingir o equilíbrio térmico (leva aproximadamente 1 hora).
      10. Enquanto o gabinete se equilibra, volte ao menu Sistema e selecione "Configurações não protegidas" e "Parâmetros da máquina". Defina a velocidade de contato da calibração de profundidade (dcal) para 1 μm/s, a velocidade de contato de indentação primária para 3 μm/s e a velocidade de contato de carga ultrabaixa para 1 μm/s.
      11. No menu Calibração, execute uma calibração de profundidade padrão nesta nova configuração.
      12. Ligue a fonte de alimentação do solenóide e ajuste-a para 10 V. Vá para o menu Experimento e selecione "Impacto" e "Ajustar deslocamento de impulso". Siga as instruções do software (prompts automáticos) para calibrar a distância de oscilação do pêndulo.
2. Monte o tecido cerebral do camundongo na célula líquida.
   1. Depois de colher todo o cérebro, armazene-o imediatamente em um meio nutriente independente de CO₂ para meios de tecido neural adulto em gelo.
   2. Quando a configuração de recuo de impacto estiver totalmente concluída, transfira cuidadosamente o cérebro para uma placa de Petri junto com um meio independente de CO₂. Corte o cérebro em seções de 6 mm de espessura com superfícies planas de cada lado.
   3. Cole o tecido fatiado no poste de amostra de alumínio com uma fina camada de adesivo de cianoacrilato.
   4. Deslize a célula líquida sobre o segundo O-ring no pino de amostra e encha a célula líquida com 5 ml de meio independente de CO₂ para imergir totalmente o tecido. Este pino de amostra é então cuidadosamente montado no estágio de translação dentro do nanoindentador instrumentado.
3. Meça a resposta de impacto do tecido cerebral.
   1. Se necessário, remova a sonda esférica e substitua-a pela sonda de interesse sem remover o braço da alavanca.
   2. No menu Sistema, selecione "Configurações não protegidas" e "Parâmetros da máquina". Altere a velocidade de contato do impacto primário para 5 μm/s.
   3. Com o sample banho baixo (direção -z) e longe do pêndulo (+direção x), mova-se na direção -x até que a ponta do braço da alavanca esteja localizada corretamente acima do banho. Mova na direção + z até que a ponta esteja totalmente submersa no banho e na frente da amostra.
   4. Usando a janela de controle do estágio de amostra, faça contato com cuidado e, em seguida, afaste o estágio da superfície de amostra em aproximadamente 30 μm.
   5. No menu Experimento, clique em "Impacto" para configurar um experimento de impacto. Escolha uma carga de impulso específica que se relacione diretamente com a velocidade de impacto resultante com base na calibração da distância de oscilação. Execute o experimento agendado.
   6. Quando o pêndulo oscilar para trás e a superfície da amostra continuar a se mover para o plano de medição, desligue o interruptor de parada do limite inferior.
   7. Observe como o pêndulo oscila para frente para impactar a amostra. O deslocamento da sonda em função do tempo será registrado pelo software.
   8. Quando a janela do estágio xyz aparecer, ligue novamente o interruptor de parada de limite.
   9. Repita as etapas 3.4 a 3.8 para testar quantas cargas e locais diferentes forem necessários.
4. Analise o deslocamento adquirido versus a resposta de tempo do pêndulo usando scripts MATLAB personalizados para determinar a profundidade máxima de penetração xmax, capacidade de dissipação de energia K e fator de qualidade de dissipação Q.
   1. Vá para o menu Análise e exporte os dados em um arquivo de texto.
   2. Pegue a derivada de tempo do perfil de deslocamento para obter a velocidade em função do tempo. Defina o deslocamento zero como o ponto de contato xo1.
      NOTA: Velocidade de impacto vin é a velocidade máxima imediatamente antes do contato. xmax corresponde à deformação na qual a velocidade da sonda diminui primeiro para zero. xo2, que é equivalente a xr, é a posição necessária para reiniciar o contato com a amostra deformada no próximo ciclo. Velocidade de rebote vout é a velocidade no deslocamento xr.
   3. Defina K (sem unidade) como a energia dissipada pela amostra normalizada pela soma das energias da amostra recuperadas e dissipadas durante o primeiro ciclo de impacto. Calcule K com base nas propriedades intrínsecas do pêndulo (como rigidez rotacional e coeficiente de amortecimento), xo1, xmax, xr, vin e vout.
   4. Como o deslocamento pode ser descrito como um movimento oscilatório harmônico amortecido, ajuste uma função de decaimento exponencial aos máximos da curva deslocamento versus tempo.
   5. Calcule Q (sem unidade) como π multiplicado pelo número de ciclos necessários para que a amplitude de oscilação diminua por um fator de e. Um valor Q mais alto significa uma taxa de dissipação de energia mais baixa.

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