Espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado por ablação a laser para visualizar metais no tecido cerebral de camundongos

Resumo

Fonte: Hare, D. J., et.al. Imagem de metais no tecido cerebral por ablação a laser - plasma indutivamente acoplado - espectrometria de massa (LA-ICP-MS). J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o uso de espectrometria de massa com plasma indutivamente acoplado por ablação a laser (LA-ICP-MS) para visualizar e quantificar as distribuições de metais no tecido cerebral de camundongos. O protocolo envolve ablação a laser para gerar um aerossol de partículas de amostra, ionização das partículas em plasma de alta temperatura e espectrometria de massa para separar os íons por suas proporções massa-carga. Um software especializado é então usado para gerar imagens quantitativas, revelando a distribuição espacial dos metais dentro do tecido.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvam amostras de animais foram revistos e aprovados pelo comité de revisão ética animal adequado.

1. Preparação do LA-ICP-MS para análise

1. Coloque os padrões e a amostra na câmara de ablação, garantindo que estejam dentro da profundidade de campo da câmera CCD instalada na unidade LA. Se for necessário afinar o instrumento, inclua um material de referência adequado (por exemplo, NIST 612 Oligoelementos em vidro). Aperte com os dedos os dois parafusos na porta da câmara para vedar a câmara de ablação.
2. No software ICP-MS, selecione abrir a válvula de gás argônio no painel 'Manutenção' ou similar e defina o fluxo de gás de arraste para 1,2 L ^min-1 na caixa de diálogo apropriada.
   NOTA: Neste protocolo, o argônio é usado como gás de arrasto. Vários exemplos usam hélio ou uma mistura de hélio e argônio como gás transportador.
3. No software LA, clique no botão 'limpar' para lavar a célula com gás argônio por um período mínimo de 30 min.
   NOTA: O tempo de purga pode ser alterado clicando em um botão 'tempo de purga' ou similar. Ao usar um sistema de ablação com uma célula de ablação de dois volumes, mova periodicamente o estágio para cada canto e atravesse diagonalmente a célula para garantir que o máximo possível de ar residual seja removido da célula. Isso pode ser feito selecionando os 'estágios iniciais' ou função equivalente.
4. Ligue o ICP-MS clicando em 'plasma on' e deixe aquecer por duas horas, durante as quais as etapas 1.5 - 2.4 podem ser realizadas. As configurações do instrumento variam entre os fabricantes.
5. Ablação representativa de padrões de tecido
   1. Selecione a ferramenta de linha e desenhe uma única linha de ablação com aproximadamente 3 mm de comprimento na superfície do tecido.
   2. Defina os parâmetros da seguinte forma, clicando com o botão direito do mouse na linha de ablação na lista de experimentos e alterando o seguinte: diâmetro do feixe (selecionado conforme apropriado pelo usuário; um feixe quadrado de 30 μm é usado aqui), velocidade de varredura (4 vezes o diâmetro do feixe por segundo; 120 μm ^s-1) e fluência de energia (0,3 -0,5 J ^cm-2 para tecidos moles; otimize, se necessário, para matrizes mais duras). Com 30 μm de espessura de tecido, o feixe de laser não penetra em toda a espessura desse tecido, eliminando qualquer contaminante potencial do suporte do microscópio. A normalização para carbono pode ser usada para corrigir a variação na quantidade de tecido ablacionado. Defina esses parâmetros como padrão para cada linha subsequente selecionando o botão de opção 'padrão'.
   3. Duplique esta linha seis vezes selecionando a linha inicial, clicando com o botão direito do mouse e selecionando 'duplicar digitalizações'. Certifique-se de que as linhas estejam deslocadas no eixo x ou y pelo diâmetro do feixe. Isso dá um total de sete linhas por padrão, espaçadas de acordo com o diâmetro do feixe.
   4. Repita as etapas 1.5.1 - 1.5.3 para cada padrão, garantindo a linha de comprimento idêntico.
6. Para desenhar a área de ablação sobre a amostra, siga um dos dois métodos a seguir:
   NOTA: Certifique-se de que os mesmos parâmetros de varredura (diâmetro do feixe, velocidade de varredura, fluência de energia) sejam usados para linhas de amostra.
   1. Se o sistema LA estiver equipado com um amplo campo de visão, selecione a ferramenta de linha e desenhe uma linha do canto superior esquerdo da amostra longa o suficiente para cobrir a amostra em seu ponto mais largo usando os mesmos parâmetros de laser descritos em 1.5. Duplique esta varredura conforme descrito em 1.5.3 com linhas espaçadas de acordo com o diâmetro do feixe quantas vezes forem necessárias para garantir a cobertura completa da amostra.
   2. Se não estiver disponível uma vista de campo amplo, determine e registe as coordenadas x e y (normalmente apresentadas no ecrã principal como «posição do palco» ou similar) correspondentes aos cantos de um rectângulo que cobre toda a amostra. Use essas coordenadas para posicionar linhas paralelas de ablação cobrindo toda a área de amostra.
   3. Traçar linhas para a varredura intermitente de padrões, o mais tardar, após ~20 h de varredura da amostra, repetindo o processo descrito em 1.5. Dependendo da duração da varredura da amostra, isso pode ser necessário várias vezes. Termine o experimento com uma varredura adicional dos padrões.
      NOTA: Ao determinar as coordenadas x e y enquanto a célula está sendo purgada, a seleção das posições iniciais e a calibração associada do eixo alterarão as especificidades adquiridas anteriormente para as coordenadas x e y, enquanto a diferença (ou seja, o comprimento da linha) não será afetada.

2. Configuração de métodos de aquisição de dados para o ICP-MS

1. Para a linha padrão de ablação, divida o comprimento da linha pela velocidade de varredura a laser para determinar o tempo total de análise para uma única linha. Repita isso para a linha de amostra.
2. No software ICP-MS, crie um novo método (mostrado aqui como um 'lote') e certifique-se de que a 'análise resolvida no tempo' ou equivalente esteja selecionada. Selecione os valores de m/z a serem detectados e, em seguida, ajuste o tempo de integração para cada m/z para que o tempo total de integração para um ciclo seja igual a 0,25 s. Clique em 'Salvar lote como' e nomeie de acordo (por exemplo, Std1).
   NOTA: Como a amostra atravessará o feixe de laser em quatro vezes o diâmetro do feixe, isso garante que um ponto de dados para cada massa seja registrado equivalente ao diâmetro do feixe. Por exemplo, usando um tamanho de ponto de 100 μm, uma velocidade de varredura de 400 μm ^s-1 com um tempo de integração de 0,25 s produzirá imagens com tamanhos de pixel reais. O tempo de integração pode ser ajustado para melhorar a sensibilidade; Ao aumentar o tempo de integração para 0,33 s, a velocidade de varredura deve ser reduzida para três vezes o diâmetro do feixe.
3. Para padrões, insira o tempo de análise para cada varredura de linha na caixa apropriada, mais 15 s adicionais para contabilizar os tempos de aquecimento e lavagem do laser. Insira uma lista de execução de amostra (ou seja, a ordem em que as verificações são executadas) com o mesmo número de aquisições (normalmente numeradas sequencialmente; ou seja, 001, 002, etc.) como o número total de linhas padrão.
4. Para a amostra, duplique o método usado para os padrões salvando o método ou lote atual com um nome de arquivo alternativo e ajuste o tempo total de aquisição (incluindo os 15 s adicionais) e o número total de aquisições para corresponder ao número de linhas que eliminarão a amostra.
   NOTA: Como a maioria dos sistemas LA-ICP-MS usa um gatilho unidirecional (LA aciona ICP-MS), é essencial que o software ICP-MS esteja aguardando o gatilho do LA antes do início da linha subsequente de ablação. A janela de aquisição do ICP-MS exibirá 'aguardando início'.

3. Executando o experimento

1. Inicie a fila ICP-MS adicionando o primeiro método ou lote à fila e certifique-se de que o software esteja aguardando o disparo do sistema LA.
2. No software LA, habilite a fonte de alimentação do laser clicando em 'emissão', clique em 'executar' e defina o tempo de aquecimento do laser para 10 s e o tempo de lavagem para 20 s nas caixas apropriadas.
   NOTA: Essa saturação garantirá que o ICP-MS esteja pronto para começar a adquirir novos dados quando o laser iniciar cada linha subsequente de ablação.
3. Inicie a sequência de laser clicando em 'iniciar'. Se estiver usando uma célula de dois volumes, certifique-se de que o copo de amostra esteja na posição.

4. Cálculo dos padrões de quantificação

NOTA: Existem várias variações para converter dados ICP-MS em imagens. Isso inclui o uso de ferramentas de software caseiras escritas em linguagens de código aberto, macros comerciais e software de análise de dados. Aqui, use o plug-in de software desenvolvido recentemente, baseado em um conjunto especializado de análise de dados LA-ICP-MS.

1. Transfira todas as pastas de lote contendo os dados de execução (001.d, 002.d, etc.) para um computador separado com o software de análise instalado. Extraia os arquivos de dados *.csv para cada linha do lote em uma pasta separada.
   OBSERVAÇÃO: é altamente recomendável usar um script para transferir automaticamente arquivos *.csv para uma nova pasta. Consulte o código Python anexado para obter mais detalhes. Este script foi escrito para se adequar a um ICP-MS da série Agilent 7700 ou 8800, mas pode ser editado para se adequar ao arquivo de saída de outros fabricantes.
2. Abra a plataforma de software e siga as guias sequencialmente para importar e analisar os padrões para produzir imagens quantitativas, conforme descrito abaixo.
3. Para importar os dados do primeiro lote padrão, selecione 'Agilent .csv' para 'Tipo de arquivo', 'Pasta inteira' para 'Tipo de importação' e verifique se o 'Formato de data' é idêntico ao formato do computador. Clique em 'Importar', selecione a pasta que contém os ficheiros .csv para o primeiro conjunto de normas e vá para o separador 'Baselines'.
4. Subtração da linha de base
   1. Use a guia 'Seleções automáticas' (comando 2) no menu suspenso do aplicativo principal na barra de ferramentas, selecione 'Informações da importação' e clique em 'Continuar'.
   2. Clique em 'Selecionar tudo' e selecione 'Baseline_1' para integração.
   3. Para selecionar os primeiros 10 s de cada linha de varredura (correspondendo ao tempo de aquecimento do laser), corte os dados inserindo os segundos valores '0' e '(duração da linha - 10 s)' e clique em 'Adicionar integrações' (por exemplo, para uma linha de varredura de 35 s, insira os valores '0' e '25').
5. Para selecionar os dados de amostra, use a guia 'Seleções automáticas' conforme descrito em 4.4, mas escolha 'Output_1' como a integração. Corte os dados do início e do fim de cada linha padrão para excluir o sinal de fundo (por exemplo, para uma linha de varredura de 35 s, insira os valores '13' e '4').
6. Para excluir quedas no sinal causadas por possíveis furos nos padrões, na guia 'Samples', clique em 'Channels' no canto superior esquerdo da área do gráfico para selecionar um canal com uma alta relação sinal-ruído (por exemplo, C13 ou P31). Anote quaisquer quedas acentuadas no sinal e selecione um valor de CPS baixo o suficiente para ficar abaixo da variação normal dentro das amostras, mas alto o suficiente para identificar as quedas acentuadas no sinal.
7. Clique na guia 'DRS' e selecione 'Baseline_Subtract' para o 'Esquema de Redução de Dados Atual'. Escolha o canal de 4.6 para 'Canal de índice' e o valor CPS para 'Limite a ser usado ao mascarar sinais baixos'. Insira um valor <0.5 s para 'Segundos para cortar antes/depois de sinais baixos' para levar em conta o atraso na transferência de sinal do laser para o ICP-MS.
8. Para confirmar o mascaramento adequado das áreas de sinal baixo, clique novamente na guia 'Samples' e selecione um rastreamento de canal processado (por exemplo, Fe56_CPS). Repita e refine os valores CPS e 'Segundos para cortar antes/depois de sinais baixos' como em 4.7, se necessário.
9. Clique na guia 'Resultados' e escolha 'Exportar dados' no menu suspenso do aplicativo principal. Insira um nome de arquivo para gerar um arquivo de dados de planilha dos resultados (por exemplo, cálculos Std1, Std2...).
10. Abra o arquivo de dados em um programa de planilha adequado e calcule os valores de CPS para cada canal individual a ser quantificado. Use as concentrações de metal predeterminadas da nebulização da solução ICP-MS para calcular o fator de conversão dos valores de CPS para ppm (μg g⁻¹) para cada elemento quantificável.
11. Repita as etapas 4.3 a 4.10 para todos os conjuntos de padrões na execução.

5. Construindo imagens quantitativas

1. Escreva 'Biolite()' no prompt de comando para abrir o software.
2. Importe os dados de amostra clicando em 'Carregar imagens' e selecionando a pasta que contém os arquivos .csv para a imagem de amostra.
3. Correção de plano de fundo
   1. Clique na guia 'Linhas de base' para aplicar a correção de plano de fundo para a amostra. Na imagem de fósforo (P31) solicitada na tela, selecione áreas do plano de fundo usando a ferramenta de desenho de retângulo. A seleção do maior número possível de regiões cria um mapa de desvio de sinal/plasma em toda a imagem para garantir uma compensação adequada desses fatores de confusão.
   2. Para tornar o sinal de fundo mais visível, selecione a ferramenta de edição de gráfico (canto superior esquerdo da imagem exibida) e clique com o botão direito do mouse na imagem. Selecione 'Modificar aparência da imagem' e altere a 'Primeira cor em Z=' para um valor negativo grande (por exemplo, -100.000). Prossiga clicando em 'Concluído'.
4. Clique na guia 'Padrões' para abrir uma tabela para fatores de correção CPS/ppm. Insira valores calculados a partir dos padrões na etapa 4.10 para cada um dos elementos. Esta etapa ajudará a corrigir o desvio de sensibilidade no ICP-MS. Clique em 'Ir!'
5. Abra o 'Navegador de dados' na guia 'Dados', que contém as imagens de cada elemento e cada etapa.
6. Para finalizar uma imagem para exportação, selecione a imagem desejada na pasta 'StdCorrImages', clique com o botão direito do mouse no nome da imagem (*_ppm) e clique em 'NewImage'. Clique com o botão direito do mouse na imagem para abrir 'Modificar aparência da imagem' para escolher uma tabela de cores e escala de cores desejadas. Adicione uma escala de cores à imagem clicando com o botão direito do mouse na imagem e selecionando 'Adicionar anotação'. Selecione 'ColorScale' no menu suspenso superior esquerdo e use as guias para modificar a escala de cores desejada.
7. Para exportar uma imagem, certifique-se de que a imagem em questão esteja selecionada e navegue até a guia 'Arquivo' e clique em 'Salvar gráficos...'. Selecione o formato desejado e salve a imagem. Como alternativa, a imagem selecionada pode ser transferida usando as ferramentas copiar e colar.
8. Repita as etapas 5.6 e 5.7 para todas as imagens de interesse.
9. Quantificando regiões discretas
   1. Para ativar as ferramentas de ROI, navegue até a guia 'Análise', 'Pacotes' e selecione 'Processamento de imagem'.
   2. Selecione a imagem desejada e navegue até a guia 'Imagem' e clique em 'ROI...'. Clique em 'Iniciar desenho de ROI' e use uma ferramenta de desenho para selecionar uma região de interesse na amostra. Para terminar de desenhar, clique em 'Concluir ROI'.
   3. Para adquirir as estatísticas do ROI selecionado, navegue até a guia 'Imagem' e clique em 'Estatísticas...'.
   4. Copie e cole os resultados em uma planilha separada. Repita a seleção de ROI (5.9.2) para todas as regiões e elementos de interesse.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Soda glass microscope slides	n/a	n/a	As lâminas típicas são adequadas para todos os experimentos
NWR213 Sistema de ablação a laser	ESI Ltd	n/a	Usado nesses experimentos. Outros fabricantes adequados, podem exigir modificações no protocolo
Agilent Série 8800 ICP-MS	Agilent Technologies	n/a	Usado nesses experimentos. Outros fabricantes adequados, podem exigir modificações no protocolo
Iolite	Iolite Software	n/a	Disponível a partir de http://iolite-software.com/. Outros métodos estão disponíveis, consulte o protocolo
Excel	Microsoft	n/a
IGOR Pro	Wave Metrics	n/a	Disponível a partir de https://www.wavemetrics.com/products/igorpro/igorpro.htm