Imagem de bioluminescência para avaliar o crescimento do tumor em uma fatia de cérebro de camundongo organotípica

Resumo

Fonte: Ciraku, L., et. al. Um modelo de fatia cerebral ex vivo para estudar e direcionar o crescimento do tumor metastático cerebral do câncer de mama. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra a imagem de células tumorais que expressam luciferase em uma fatia de cérebro de camundongo organotípica. A luciferina é adicionada ao meio e a placa é colocada dentro da câmara do sistema de imagem in vivo. Os parâmetros para captura de imagem são ajustados e a forma e o tamanho do tumor são definidos. Os sinais bioluminescentes emitidos pelas células tumorais são então registrados.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

Nota: Camundongos fêmeas nu/nu atímicos (6-8 semanas de idade) foram usados neste estudo.

1. Injeção intracraniana de células tumorais

1. Esterilize todos os equipamentos (pinças, tesouras, tesouras de sutura, broca manual) sob um ciclo seco de autoclave por até 45 min em bolsas de esterilização, incluindo um indicador de esterilização. Se as cirurgias forem realizadas em vários animais, esterilize as ferramentas entre os animais usando um esterilizador de esferas aquecidas (até 3x).
2. Anestesiar os camundongos de acordo com o protocolo de cuidados com os animais dos usuários (por exemplo, isoflurano (4% para indução, 1-2% manutenção) e administrar analgesia (subcutâneo, 0,1 mL de 0,1 mg / kg de buprenorfina SR-LAB) antes do início da cirurgia. Garanta a profundidade ideal da anestesia com um beliscão no dedo do pé.
3. Coloque os ratos em uma estrutura estereotáxica e imobilize a cabeça usando barras de ouvido padrão (Figura 1A). Em seguida, aplique pomada oftálmica nos olhos.
4. Esterilize a superfície da cabeça por aplicação repetida e alternada (3x) de cotonetes de iodo e etanol a 70% antes da incisão.
5. Use um bisturi cirúrgico para fazer uma incisão na linha média de 1 cm através da pele em um ângulo ligeiramente diagonal em relação à linha imaginária que divide o cérebro do camundongo em duas metades simétricas para expor o crânio. Limpe qualquer sangue com um cotonete.
6. Desvie a pele lateralmente para expor o local da injeção: 2 mm à direita, 1 mm para a frente com referência ao bregma +2 mediolateral (+2ML), +1 rostral/caudal (+1RC).
7. Use uma broca (0,73 mm) para penetrar no crânio +2ML, +1RC no bregma e faça um furo usando uma leve pressão e movimento de torção.
8. Use uma seringa de injeção cerebral para injetar 5 μL de uma solução de 100.000 células MDA-MB-231BR (proteína fluorescente verde que expressa de forma estável ou GFP-Luciferase) / μL em solução salina estéril 1x tampão fosfato (PBS) inserindo inicialmente a seringa com 3,5 mm de profundidade no cérebro.
9. Deixe a seringa repousar durante 2 min. Puxe-a cerca de 1 mm para cima e, após 2 min, injete lentamente a primeira metade do volume.
10. Aguarde mais 2 minutos antes de injetar o restante e, em seguida, puxe lentamente a seringa 3 minutos após a injeção final. nota: A injeção lenta é empírica ao permitir que o volume seja bem absorvido pelo tecido cerebral e não crie vazamento após puxar a seringa, o que pode levar ao crescimento de células cancerígenas fora do local pretendido.
11. Aplique cera óssea no local da injeção no crânio e, em seguida, use suturas de polipropileno para suturar o tecido. Os camundongos se recuperarão dentro de 5 minutos após a remoção da anestesia.
12. Monitore seu comportamento logo após a cirurgia por cerca de 10 minutos, 3 horas depois e no dia seguinte para determinar se é necessário um tratamento especial, incluindo injeção salina, alimentos macios, etc., para ajudar na recuperação rápida.
13. Monitore o crescimento do tumor por meio de imagens de bioluminescência no sistema de imagem.
    1. Para isso, primeiro ligue o oxigênio e o isoflurano no sistema de imagem. Permita que ambos sejam distribuídos para uma câmara separada fora da caixa de imagem.
    2. Em seguida, ligue o software, inicialize o instrumento e escolha a opção apropriada para visualizar e capturar todo o corpo do mouse.
14. Coloque os camundongos em uma câmara separada com isoflurano e garanta a profundidade ideal da anestesia com uma pitada no dedo do pé. Injete nos camundongos por via intraperitoneal 200 μL de 30 mg / mL de luciferina.
15. Transfira o estômago do camundongo para o nariz da câmara de imagem abastecido com oxigênio e isoflurano. Tranque a câmara e escolha 2 minutos de exposição para iniciar a geração de imagens.
16. Use a ferramenta ROI (região de interesse) do software para quantificar o sinal bioluminescente do tumor.
17. Para analisar o tamanho do tumor, escolha a ferramenta de forma circular para ajustá-lo à forma e ao tamanho do tumor. Meça o ROI e relate as leituras totais.
18. Permita o crescimento do tumor sólido por 12-14 dias (ou até que a luciferase atinja cerca de 7,0 x 10⁶ unidades) (Figura 1B) antes de gerar fatias cerebrais. nota: Aumentar o número de células a serem injetadas levará a um crescimento tumoral mais rápido; portanto, a geração de fatias de cérebro pode ocorrer antes de 12 dias. Por outro lado, um tumor maior levará a mais fatias de GFP+ se crescer por 14 dias. Após 14 dias, a saúde dos camundongos começa a se deteriorar rapidamente; Portanto, o monitoramento da saúde animal deve ser aumentado para uma vez ao dia após o período de 10 dias, e quaisquer camundongos que apresentem sinais de dor e/ou desconforto devem ser usados para gerar as fatias.

2. Gerar fatias de cérebro

NOTA: Execute as etapas após o isolamento do cérebro em uma capela de fluxo laminar estéril. Normalmente, é possível gerar 35-40 fatias individuais contendo células tumorais (sinal de luciferase) de um camundongo injetado com células MDA-MB-231BR (Figura 1C).

1. Esterilize todas as ferramentas cirúrgicas em autoclave. Coloque o cortador de lenços de papel na capela de fluxo laminar estéril e limpe todas as ferramentas e instrumentos com etanol a 70%.
2. Após 12-14 dias após a injeção intracraniana de células MDA-MB-231BR, anestesiar os camundongos de acordo com o protocolo de cuidados com os animais do usuário, conforme descrito em 1.2. Garanta a profundidade ideal da anestesia com um beliscão no dedo do pé.
3. Remover e colocar os seus cérebros rapidamente (dentro de 45 s) no líquido cefalorraquidiano artificial de sacarose gelado (4 °C) ou sacarose-ACSF composto pelo seguinte: 280 mM de sacarose, 5 mM de cloreto de potássio (KCl), 2 mM de cloreto de magnésio (MgCl₂), 1 mM de cloreto de cálcio (CaCl₂), 20 mM de glicose, 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfónico ou HEPES, 5 mM de ascorbato de sódio (Na+), 3 mM de tioureia, 2 mM de Na+, 29 mM de piruvato; pH=7,3.
4. Usando um bisturi afiado e estéril ou lâmina de barbear, corte o excesso de partes do cérebro que não contêm nenhum tumor de todos os lados, incluindo a parte inferior do cérebro.
5. Traga a forma do cérebro para um cubo não perfeito para ficar plano no papel de filtro umedecido com ACSF em uma tampa de prato de 60 mm para facilitar o corte. nota: O tecido extra do cérebro onde é improvável que o tumor tenha crescido é removido antes do corte para permitir a geração de fatias principalmente GFP + e criar uma forma do cérebro que seja estável na superfície do instrumento e não seja perturbada pelas vibrações causadas pelo corte.
6. Coloque várias folhas de círculos de papel de filtro pré-úmidos (com ACSF) na plataforma de corte e coloque o tecido bloqueado sobre ela.
7. Defina o tamanho do corte no instrumento para 2 ou 2,5 unidades na régua fornecida para cortar o tecido em seções de 200-250 μm. nota: Fatias de até 350 μm ou tão finas quanto 100 μm são viáveis. Para fatias <200 μm, use um vibratomo ou compresstome.
8. Use um pincel (zibelina) para transferir fatias de cérebro para um prato contendo sacarose ACSF e separe as fatias em um microscópio óptico usando agulhas de 27 G.
9. Identifique fatias positivas para GFP sob o microscópio fluorescente e transfira-as para um novo prato de 60 mm contendo 2-3 mL de meio de fatia adulto (meio neurobasal A, suplemento de 2% de B12, suplemento de 1% de N2, 1% de glutamina, 0,5% de glicose, 10 U / mL de penicilina e 100 μg / mL de estreptomicina) usando uma pipeta estéril de 1 mL quebrada (abertura larga). nota: As fatias de cérebro que contêm células tumorais crescendo sobre a superfície do cérebro (talvez devido ao vazamento de células de injeção, etc.) são excluídas.
10. Transfira 3-5 fatias para cada inserto de cultura de tecidos de 30 mm, tamanho de poro de 0,4 μm em placas de 6 poços a uma distância que não permita o crescimento umas nas outras.
11. Remova o excesso de meio da superfície do inserto usando uma pipeta P1000, adicione 1 mL de meio de fatia de camundongo adulto embaixo de cada inserto e equilibre o meio na incubadora antes de fatiar.
12. Incube os tecidos a 37 °C, 5% de CO₂ e 95% de umidade por 24 h antes da imagem.

3. Imagem de fatias do Sistema de Imagem In Vivo (IVIS)

NOTA: Execute as etapas de adição de luciferase e inibidor em uma capela de fluxo laminar estéril.

1. Pipete 5 μL de solução de luciferina a 30 mg / mL no meio abaixo das inserções, levantando a inserção com uma pinça e colocando-a de volta no poço após a adição de luciferina ao meio no poço.
2. Coloque a placa de 6 poços com a tampa dentro da câmara de imagem do instrumento abaixo da câmera estacionária e tranque a porta da câmara.
3. Abra o software e inicialize o instrumento.
4. Escolha configurações de câmera que permitam a visualização e captura de apenas um poço por imagem. Mova o palco para cima (campo de visão ou FOV de 5 cm) e coloque o poço que deve ser fotografado diretamente sob a câmera.
5. Defina o tempo de imagem para o mais apropriado, dependendo da intensidade da luciferase que o tumor emitirá, que pode variar de 10 s a 5 min. Comece configurando-o para 10 s e depois aumente se o sinal estiver baixo, mas mantenha-o consistente para todos os pontos de tempo e condições até o final do experimento (Figura 1D).
6. Use a ferramenta ROI (ferramenta de forma circular), ajuste-a ao redor da forma e tamanho do tumor, meça o ROI e relate as leituras totais para quantificar o sinal bioluminescente de cada tumor na fatia.

Resultados

Figura 1. Injeção intracraniana, geração de fatias cerebrais e crescimento de BCBM ex vivo. (A) Representação esquemática de um camundongo durante a injeção intracraniana sob um instrumento estereotáxico. (B) Imagens representativas da dete...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 mL seringa, ponta deslizante	BD	309659
30 G1/2 Agulhas	BD	305106
placas de 6 poços	Genessee	25-105
Microscópio automatizado e software LUMAVIEW	Etaluma	LS720
B27 (GEM21)	Gemini Bio-Products	400-160
Béquer 50 mL	Pincel	10-210-685
, Tamanho #5/0	Electroon Microscopy Sciences	66100-50
Cera Óssea	Seringa
	Hamilton Company	80430
CaCl₂	Fisher Scientific	BP510-250
D-Luciferina Sal de Potássio	Perkin Elmer	122799
Lâmina de barbear de dupla borda	VWR	55411-060(95-0043)
Papel de Filtro , círculos quantitativos, 4,25 cm	Fisher	09-805a (1001-042)
Pincel de zibelina fina #2/0	Eletrônica Microscopia Sciences	66100-20
Fórceps	Ferramentas de Ciência Fina	11251-20
	Glicose Sigma Glutamina Aldrich	G8270
(200 mM)	Corning cellgrow	25-005-Cl
Conjunto de Brocas Manuais com Mini Brocas de Torção Micro Amazon		YCQ2851920086082DJ
HEPES, ácido livre	Fisher Scientific	BP299-1
Apenas para camundongos Quadro Estereotáxico	Harvard Apparatus (Holliston, MA, EUA).	72-6049, 72-6044
KCl	Fisher Scientific	S271-10
Tesoura cirúrgica grande	Ferramentas de ciência fina	14001-18
Células MDA-MB-231BR	Gentilmente fornecido pela Dra. Patricia Steeg	Ref 14
MgCl₂·6H₂O	Fisher Scientific	M33-500
Dispositivo de imagem de camundongos	Perkin Elmer	IVIS 200 sistema
Software de imagem de ratos	Caliper Life Sciences (Waltham, MA, EUA).	Leitor de microplacas de software
	Tecan Spark
Mounting solution	Invitrogen	P36935
MTS reagente	Promega CellTiter 96 Solução aquosa	única (Cat: G3582)
suplemento N2	Life Technologies	17502-048
Neurobasal medium	Life Tecnologias	21103049
camundongos atímicos Nu/Nu	Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, EUA)
Paraformaldeído	Affymetrix	19943
Pen/Strep	Life Technologies	145140-122
Sutura de polipropileno	Medex fornecimento	ETH-8556H
Cotonete de iodopovidona sticks	DME Supply USA	Cat: 689286X
Lâmina de bisturi #11 (pk de 100)	Fine Science Tools	10011-00
Cabo de bisturi #3	Fine Science Tools	10003-12
Sódio Pyruvate	Sigma Aldrich	S8636
Espátula/sonda	Fine Science Tools	10090-13
Lâminas de barbear não revestidas de dupla borda SS (American safety razor co (95-0043))VWR		55411-060
Sucrose	Amresco	57-50-1
Bisturi Cirúrgico	Exelint International	D29702
Tissue Chopper	Brinkman	(tipo McIlwain)
Inserções de cultura de tecidos	Millipore	PICMORG50 ou PICM03050

de zibelina Fisher de Injeção Cerebral DYNJBW25 ModoMedde imagem viva