Imagem de segunda geração harmônica em um modelo de rato para estudar defeitos de tubulina

Resumo

Fonte: Piazza, V., et al., Óptica não linear sem rótulo para o estudo de defeitos dependentes de tubulina na mielina central. J. Vis. Exp. (2023)

Este vídeo demonstra o procedimento para obter imagens de anormalidades de microtúbulos em uma fatia de tecido cerebral de rato usando um microscópio de excitação de dois fótons. Ele emprega sinais de geração de segundo harmônico (SHG) para detectar defeitos de tubulina e reduzir a produção de mielina.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Transfira para o microscópio

1. Se o microscópio estiver em uma sala diferente, prepare uma caixa isolada com pacotes de gel aquecidos para transferir as seções de tecido enquanto mantém a temperatura. A caixa também manterá as seções aquecidas até que sejam fotografadas.
2. Coloque a amostra sob o microscópio e certifique-se de que ela esteja posicionada corretamente sob a objetiva por observação direta através das oculares com luz transmitida.
   NOTA: O objetivo é alinhar as estruturas emissoras previstas com a direção de oscilação do laser para maximizar o sinal de geração de segundo harmônico (SHG) emitido (e, portanto, detectado).
3. Remova o excesso de HBSS para que uma fina película líquida cubra toda a amostra. Verifique visualmente o filme líquido a cada poucos minutos para evitar evaporação excessiva e secagem da amostra.
   NOTA: Nas condições descritas, uma seção é usada por no máximo 20 min. A secagem da amostra causa efeitos artefactuais drásticos (Figura 1A). Se forem necessários tempos de imagem mais longos, recomenda-se a imersão periódica da seção em um meio quente e fresco, em vez de adicionar mais HBSS. O uso de câmaras de perfusão e cola ou agarose de baixo ponto de fusão para imobilizar o tecido também é recomendado quando experimentos mais longos devem ser feitos.
4. Prepare o estágio do microscópio para imagens não digitalizadas, o que pode incluir o fechamento de todas as portas da câmara de incubação escura ou a cobertura da câmara de incubação com um tecido revestido de poliuretano de nylon preto.

2. Imagem

1. Selecione o modo de imagem "não digitalizado" ao longo do caminho de transmissão. Desta forma, a captura do sinal SH fraco da tubulina será otimizada.
2. Selecione a objetiva LCI Plan-Neofluar 25x/0,8 NA.
3. Defina uma potência de laser entre 13 mW e 26 mW, com um tempo de permanência de pixel de 12,6 μs. Tire imagens não maiores que 512 pixels x 512 pixels, com uma velocidade de 5 e média de 2, para um tempo médio de aquisição de cerca de 15 s.
   NOTA: O uso de potências de laser mais altas e/ou tempos de permanência mais longos pode danificar a amostra (Figura 1B).
4. Tire imagens primeiro usando um filtro passa-curta de 485 nm (SP485) e, em uma segunda etapa, adicione um filtro passa-banda nítido de 405 nm (BP405; Figura 2).
   NOTA: Imagens de pseudo-campo claro podem ser tiradas através do mesmo detector usando a luz laser residual de uma linha visível (lasers de 405 nm ou 488 nm funcionam melhor).

Resultados

Figura 1: Exemplos de artefatos. (A) Artefato devido à secagem da amostra. (B) Artefato devido à exposição excessiva. Barras de escala: 30 μm.

Materiais