Imagem confocal com lapso de tempo da dinâmica dendrítica neuronal em explantes retinianos de camundongos

Resumo

Fonte: Ing-Esteves, S. & Lefebvre, J. L. Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra o uso da microscopia confocal para visualizar a dinâmica dendrítica em explantes retinianos de camundongos vivos. Ele descreve as etapas para estabilizar a retina sob um microscópio confocal, realizando imagens de epifluorescência para visualizar interneurônios amácrinos starburst e capturando imagens 3D de lapso de tempo para monitorar mudanças na morfologia dendrítica amácrina.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Imagens confocais com lapso de tempo de preparações de retina de montagem total ao vivo

1. Monte a câmara de incubação de imagem ao vivo para um microscópio confocal vertical, como visto em Figura 1.
   NOTA: Para sistemas confocais invertidos, as montagens planas são colocadas com as células ganglionares da retina (RGC) voltadas para baixo diretamente na lamínula do fundo de vidro da câmara de incubação. Uma vez que as retinas entram em contato com a lamínula, elas não podem ser movidas.
2. Encha a câmara com líquido cefalorraquidiano artificial oxigenado (aCSF) e ligue a bomba e o controlador de temperatura (temperatura 32-34 °C, vazão de 1 mL/min). Não permita que a temperatura suba acima de 34 °C.
3. Para transferir o suporte plano da retina para a câmara de perfusão, pare a bomba e remova o aCSF que está na câmara. Colocar o disco de éster misto de celulose (MCE) com o suporte plano da retina na câmara de incubação (vazia).
4. Coloque um sample peso na montagem plana; pré-umedeça o peso para quebrar a tensão superficial. Reabasteça a câmara com o aCSF aquecido e circule o aCSF a ~ 1 mL / min.
5. Posicione o revólver com a objetiva de imersão em água de 25x (abertura numérica de 0,95) na câmara de imagem. Rastreie as células marcadas de interesse usando luz epifluorescente (Figura 1C).
6. Ajuste o volume da imagem para capturar características dendríticas de interesse.
   NOTA: Este estudo capturou a árvore dendrítica completa em 1024 x 1024 pixels por quadro, z-step 1 μm e uma taxa de quadros de 2 min entre cada z-stack. Os tamanhos finais da imagem são ~100 μm x 100 μm x 20 μm.
7. Para ajustar a potência do laser para uma configuração ideal, use uma tabela de pesquisa que identifique pixels supersaturados e subsaturados. Durante a digitalização, ajuste a potência do laser de forma que nenhum pixel fique supersaturado (ou seja, com uma intensidade de 255 ou superior). Continue a imagem pelo tempo necessário ou até que haja um declínio significativo e detectável no sinal fluorescente e um aumento no ruído (normalmente 2-4 h).
   NOTA: Recomenda-se a redução da potência do laser, pois os algoritmos de deconvolução funcionam de maneira ideal quando os pixels são distribuídos em toda a faixa dinâmica. A intensidade do pixel não deve exceder 254; Análises empíricas de neuritos revelaram que valores de pixel abaixo de 170 são ideais para deconvolução. Velocidades de varredura rápidas (400-600 Hz) com média de linha (2-3) são preferíveis a varreduras únicas e mais lentas do mesmo tempo total de permanência de pixels. A área de imagem prolongada geralmente fotobranqueia, mas outras seções de explante permanecem viáveis. Várias regiões em uma montagem plana podem ser fotografadas, cada uma por 2-4 h, com um tempo total de incubação de 6 horas. As sessões de imagem superiores a 6 h não foram sistematicamente testadas. A degradação e o sangramento de neuritos são sinais de que a viabilidade do explante está em declínio.

Resultados

Figura 1: Configuração da câmara de incubação de imagens de células vivas. (A) Aparelho de incubação de imagem ao vivo mostrando aquecimento, solução e componentes de imagem. O aquecedor duplo inclui uma plataforma de câmara de incubação aque...

Materiais