Imagem e quantificação da regeneração axonal em neurônios ganglionares retinianos de ratos axotomizados

Neste artigo

Resumo

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Fonte: Portela-Lomba, M., et. al. Cocultura de neurônios ganglionares da retina de ratos axotomizados com glia de revestimento olfativo, como um modelo in vitro de regeneração axonal adulta. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra imagens e quantificação da regeneração axonal em neurônios ganglionares da retina (RGNs) de ratos axotomizados co-cultivados com células da glia olfativas humanas imortalizadas. Os RGNs são imunomarcados, com somas vermelhos e axônios verdes. As imagens foram capturadas usando um microscópio de epifluorescência, e a porcentagem de neurônios com um axônio e índice de regeneração axonal foi quantificada usando um software de imagem.

Protocolo

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Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Cultura de Glia de Revestimento Olfativo Humano (ihOEG, Ts12 e Ts14)

NOTA: Este procedimento é feito em condições estéreis em um gabinete de biossegurança de cultura de tecidos.

Prepare 50 mL de meio de cultura ME10 OEG.
Prepare 5 mL de meio de águia modificado de Dulbecco ou DMEM / F12-Fetal Bovine Serum (FBS), em um tubo cônico de 15 mL.
Aqueça ambos os meios a 37 °C em banho-maria limpo por 15 min.
Descongele os frascos para injetáveis de células Ts12 e Ts14 a 37 °C em ba....

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Antibody 514	Referência 34		Anti-soro policlonal de coelho, que reconhece MAP2A e B.
Anticorpo SMI-31	BioLegend	801601	Anticorpo monoclonal contra as proteínas MAP1B e NF-H
Anticorpo anti-camundongo Alexa Fluor 488	ThermoFisher	A-21202
Anticorpo anti-coelho Alexa Fluor 594	ThermoFisher	A-21207
B-27 Suplemento	Gibco	17504044
D, ácido L-2-amino-5-fosfonovalérico	Sigma	283967	inibidor do receptor NMDA
DAPI	Sigma	D9542	Núcleo coloração fluorescente
DMEM-F12	Gibco	11320033	Meio de cultura de células
FBS	Gibco	11573397	Soro bovino fetal
FBS-Hyclone	Fisher Scientific	16291082	Soro bovino fetal
Fluoromount	Southern Biotech	0100-01	Meio de montagem
ImageJ	National Institutes of Health (NIH-USA)		Software de imagem
L-Glutamina	Lonza	BE17-605F
Meio neurobasal	Gibco	21103049	Meio de cultura de células neuronais
Sistema de dissociação de papaína	Worthington Biochemical Corporation	LK003150	Para uso em células neurais isolamento
PBS	Home made
PBS-EDTA	Lonza	H3BE02-017F
Penicilina / Estreptomicina / Anfotericina B	Lonza	17-745E	Extrato bacteriostático e bactericida
da hipófise	Gibco	13028014	Extrato de hipófise bovina
Poli-L-lisina (PLL)	Sigma	A-003-M

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