Imagem e quantificação da regeneração axonal em neurônios ganglionares retinianos de ratos axotomizados

Resumo

Fonte: Portela-Lomba, M., et. al. Cocultura de neurônios ganglionares da retina de ratos axotomizados com glia de revestimento olfativo, como um modelo in vitro de regeneração axonal adulta. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra imagens e quantificação da regeneração axonal em neurônios ganglionares da retina (RGNs) de ratos axotomizados co-cultivados com células da glia olfativas humanas imortalizadas. Os RGNs são imunomarcados, com somas vermelhos e axônios verdes. As imagens foram capturadas usando um microscópio de epifluorescência, e a porcentagem de neurônios com um axônio e índice de regeneração axonal foi quantificada usando um software de imagem.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Cultura de Glia de Revestimento Olfativo Humano (ihOEG, Ts12 e Ts14)

NOTA: Este procedimento é feito em condições estéreis em um gabinete de biossegurança de cultura de tecidos.

1. Prepare 50 mL de meio de cultura ME10 OEG.
2. Prepare 5 mL de meio de águia modificado de Dulbecco ou DMEM / F12-Fetal Bovine Serum (FBS), em um tubo cônico de 15 mL.
3. Aqueça ambos os meios a 37 °C em banho-maria limpo por 15 min.
4. Descongele os frascos para injetáveis de células Ts12 e Ts14 a 37 °C em banho-maria limpo.
5. Ressuspenda e adicione células ao meio de cultura DMEM/F12-FBS preparado na etapa 2.
6. Centrifugue por 5 min a 200 x g.
7. Aspire o sobrenadante.
8. Adicione 500 μL de meio ME10 e ressuspenda o pellet.
9. Prepare uma placa de cultura de células p60 com 3 mL de ME10 e adicione a suspensão celular gota a gota.
10. Mova-se para distribuir as células uniformemente pela placa.
11. Células de cultura a 37 °C em 5% de CO₂.
    NOTA: Depois de atingir a confluência, pelo menos outra passagem deve ser feita para otimizar as células para cocultura. É necessária 90% de confluência antes de semeá-los nas lamínulas para cocultura. Um p-60 confluente tem um número médio de células de 7 x 10⁵ para Ts14 e 2,5 x 10⁶ para linhagens celulares Ts12. As linhagens celulares Ts12 e Ts14 devem ser passadas a cada 2-3 dias.

2. Preparação de ihOEG (Ts12 e Ts14) para o ensaio

NOTA: Esta etapa deve ser feita 24 horas antes da dissecção e cocultura dos neurônios ganglionares da retina (RGNs).

1. Trate lamínulas de 12 mm Ø com 10 μg/mL de poli-L-lisina (PLL) por 1 h.
   NOTA: As lamínulas podem ser deixadas durante a noite na solução de PLL.
2. Lave as lamínulas com 1x tampão fosfato salino (PBS) três vezes.
3. Separe as células Ts12 e Ts14 ihOEG da placa de cultura de células p60.
   1. Adicione 4 mL de meio de cultura DMEM/F12-FBS a um tubo cônico de 15 mL. Aquecer a 37 °C em banho-maria limpo.
   2. Remova o meio das placas e lave as células uma vez com 1 mL de 1x ácido PBS-etilenodiaminotetracético (EDTA).
   3. Adicione 1 mL de tripsina-EDTA às células OEG e incube por 3–5 min a 37 °C, 5% CO₂.
   4. Colete as células com uma pipeta p1000 e transfira-as para o meio preparado na etapa 3.1.
   5. Centrifugue por 5 min a 200 x g.
   6. Aspire o sobrenadante.
   7. Adicione 1 mL de meio ME10 e ressuspenda o pellet.
   8. Conte o número de células em um hemocitômetro.
4. Semear 80.000 células Ts14 ou 100.000 células Ts12/poço nas lamínulas em placas de 24 poços em 500 μL de meio ME10.
5. Células de cultura a 37 °C em 5% de CO₂ por 24 h.

3. Dissecção do tecido retiniano

NOTA: Ratos Wistar machos de 2 meses de idade são usados como fonte RGN. Duas retinas (um rato) para 20 poços de um prato de células de 24 poços. Autoclave o material cirúrgico antes do uso. O kit de dissociação de papaína é comprado comercialmente (Tabela de Materiais). Siga as instruções do provedor para reconstituição. Reconstituir o ácido D, L-2-amino-5-fosfonovalérico (APV) em massa 5 mM e preparar as alíquotas.

1. No dia do ensaio, prepare a seguinte mídia.
   1. Prepare uma placa de cultura de células p60 com 5 mL de solução salina balanceada de Earle fria ou EBSS (frasco 1 do kit de dissociação de papaína).
   2. Prepare uma placa de cultura de células p60 com o frasco 2 reconstituído (papaína) do kit de dissociação da papaína mais 50 μL de APV. Em seguida, adicione 250 μL de frasco para injetáveis reconstituído 3 (DNase mais 5 μL de APV).
   3. Em um tubo estéril, misture 2,7 mL do frasco 1 com 300 μL do frasco 4 (inibidor da protease albumina-ovomucóide). Adicione 150 μL de frasco para injetáveis 3 (DNase) mais 30 μL de APV.
   4. Prepare 20 mL de meio Neurobasal-B27 (NB-B27).
2. Sacrifique um rato por asfixia com CO₂.
3. Remova a cabeça por decapitação com uma guilhotina; colocá-lo em uma placa de Petri de 100 mm e pulverizar a cabeça com etanol 70% antes de colocá-lo em uma capela de fluxo laminar.
4. Corte os bigodes do rato com uma tesoura para que não interfiram na manipulação dos olhos.
5. Segure o nervo óptico com uma pinça para puxar o globo ocular o suficiente para poder fazer uma incisão no olho com um bisturi.
6. Remova o cristalino e o humor vítreo e retire a retina (tecido semelhante a laranja), enquanto as camadas restantes do olho permanecem dentro (incluindo a camada epitelial pigmentar).
7. Colocar a retina na placa de cultura de células p60 preparada no passo 3.1.1.
8. Transferir a retina para a placa de cultura de células p60 preparada no passo 3.1.2 e cortá-la com o bisturi em pequenos pedaços de tamanho aproximado < 1 mm.
9. Transferir para um tubo de plástico de 15 ml.
10. Incubar o tecido por 30 min em uma incubadora umidificada a 37 °C sob 5% de CO₂, com agitação a cada 10 min.
11. Dissocie os aglomerados de células pipetando para cima e para baixo com uma pipeta de vidro Pasteur.
12. Centrifugar a suspensão celular a 200 x g durante 5 min.
13. Rejeitar o sobrenadante e, para inactivar a papaína, ressuspender o sedimento celular na solução preparada no passo 3.1.3. (1,5 mL para 2 olhos).
14. Pipete cuidadosamente esta suspensão celular para 5 ml de frasco reconstituído 4.
15. Centrifugue a 200 x g por 5 min.
16. Durante a centrifugação, remova completamente o meio ME-10 da placa de célula de 24 poços OEG (previamente preparada na etapa 2) e substitua-o por 500 μL de meio NB-B27 por poço.
17. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender as células em 2 ml de meio NB-B27.
18. Placa de 100 μL de suspensão de células da retina, por poço da placa m24, em lamínulas de monocamadas tratadas com PLL ou OEG.
19. Manter as culturas a 37 °C com 5% de CO₂ durante 96 h em meio NB-B27.

4. Imunocoloração

1. Após 96 h, fixe as células por 10 min adicionando o mesmo volume de paraformaldeído (PFA) a 4% em 1x PBS ao meio de cultura (600 μL) (concentração final de PFA 2%).
2. Remova o meio e o PFA da placa de 24 poços múltiplos e adicione novamente 500 μL de paraformaldeído (PFA) a 4% em 1x PBS. Incube por 10 min.
3. Descarte o fixador e lave 3 vezes com 1x PBS por 5 min.
4. Bloco com 0,1% Triton X-100/1% FBS em PBS (PBS-TS) por 30–40 min.
5. Prepare os anticorpos primários em tampão PBS-TS da seguinte forma: Anticorpo monoclonal SMI31 (contra as proteínas MAP1B e NF-H) (1:500). 514 (reconhece as proteínas MAP2A e B) anti-soro policlonal de coelho (1:400).
6. Adicione anticorpos primários às coculturas e incube durante a noite a 4 °C.
7. No dia seguinte, descarte os anticorpos e lave as lamínulas com 1x PBS, 3 vezes, por 5 min.
8. Prepare os anticorpos secundários em tampão PBS-TS da seguinte forma: Para SMI-31, anti-camundongo Alexa Fluor 488 (1:500). Para 514, anti-coelho Alexa-594 (1:500).
9. Incubar as células com os anticorpos secundários fluorescentes correspondentes durante 1 h, à temperatura ambiente ou RT no escuro.
10. Lave as lamínulas com 1x PBS, 3 vezes, por 5 min, no escuro.
11. Por fim, monte lamínulas com meio de montagem (Tabela de Materiais) e mantenha-as a 4 °C.
    NOTA: Sempre que necessário, pode ser realizada coloração de núcleos fluorescentes com DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindo). Antes da montagem, incube as células por 10 min no escuro com DAPI (10 μg/mL em 1x PBS). Lave as lamínulas 3 vezes com 1x PBS e, finalmente, monte as lamínulas com o meio de montagem.

5. Quantificação da regeneração axonal

NOTA: As amostras são quantificadas sob a objetiva de 40x de um microscópio de epifluorescência. Um mínimo de 30 fotos devem ser tiradas em campos aleatórios, com pelo menos 200 neurônios, para serem quantificadas para cada tratamento. Cada experiência deve ser repetida no mínimo três vezes.

1. Quantifique a porcentagem de neurônios com axônio (neurite positivo para SMI31) em relação à população total de RGNs (identificados com imunomarcação positiva para MAP2A / B 514 do corpo neuronal e dendritos).
2. Quantifique o índice de regeneração axonal ou comprimento axonal médio (μm/neurônio). Este parâmetro é definido como a soma dos comprimentos (em μm) de todos os axônios identificados, dividido pelo número total de neurônios contados, se eles apresentaram um axônio ou não. O comprimento axonal é determinado usando o plugin NeuronJ do software de imagem ImageJ (NIH-USA).
3. Calcule a média, o desvio padrão e a significância estatística usando o software apropriado.

Materiais