Imagem celular usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total

Abstract

Fonte: Daniele, F., et. al TIRFM e sondas GFP sensíveis ao pH para avaliar a dinâmica da vesícula do neurotransmissor em células de neuroblastoma SH-SY5Y: imagem celular e análise de dados. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra a imagem de células de neuroblastoma humano usando um microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) para visualizar vesículas sinápticas marcadas com fluoróforo. As células são focadas primeiro no modo de epifluorescência. Os ajustes são então feitos para alcançar a reflexão interna total, gerando ondas evanescentes que excitam seletivamente os fluoróforos próximos à membrana. Antes da imagem TIRF, os parâmetros de aquisição são configurados e a frequência de amostragem é definida.

Protocol

1. Cultura de células e transfecção

1. Cultura de células SH-SY5Y
   NOTA: Os experimentos foram realizados usando o neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266). As células SH-SY5Y crescem como uma mistura de aglomerados flutuantes e células aderentes. Siga as instruções relatadas no protocolo (densidade celular, taxa de divisão, etc.) para ter células que crescem firmemente presas à tampa de vidro, o que é crucial para a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM).
   1. Antes de começar, sob o gabinete de biossegurança de fluxo laminar, faça o volume oportuno de solução salina de tampão f....

Results

Figura 1. Microscópio TIRF configurado. Vista esquemática e imagem (inserção) do sistema de microscópio TIRF. A configuração compreende o microscópio invertido motorizado Axio Observer Z1 (A), um laser de íons de argônio de 100 mW de várias.......

Materials