Imagem celular usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total

Abstract

Fonte: Daniele, F., et. al TIRFM e sondas GFP sensíveis ao pH para avaliar a dinâmica da vesícula do neurotransmissor em células de neuroblastoma SH-SY5Y: imagem celular e análise de dados. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra a imagem de células de neuroblastoma humano usando um microscópio de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) para visualizar vesículas sinápticas marcadas com fluoróforo. As células são focadas primeiro no modo de epifluorescência. Os ajustes são então feitos para alcançar a reflexão interna total, gerando ondas evanescentes que excitam seletivamente os fluoróforos próximos à membrana. Antes da imagem TIRF, os parâmetros de aquisição são configurados e a frequência de amostragem é definida.

Protocol

1. Cultura de células e transfecção

1. Cultura de células SH-SY5Y
   NOTA: Os experimentos foram realizados usando o neuroblastoma humano SH-SY5Y (ATCC# CRL-2266). As células SH-SY5Y crescem como uma mistura de aglomerados flutuantes e células aderentes. Siga as instruções relatadas no protocolo (densidade celular, taxa de divisão, etc.) para ter células que crescem firmemente presas à tampa de vidro, o que é crucial para a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRFM).
   1. Antes de começar, sob o gabinete de biossegurança de fluxo laminar, faça o volume oportuno de solução salina de tampão fosfato estéril (PBS) e meio de cultura.
      1. Faça 50 ml de PBS com concentrações de 150 mM de cloreto de sódio (NaCl), 24 mM de tampão fosfato, pH 7,4. Filtre a solução.
      2. Faça 50 ml de meio celular a partir do meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) com alto teor de glicose, 10% de soro fetal bovino inativado pelo calor (FBS), penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 μg/ml), L-glutamina (2 mM) e piruvato de sódio (1 mM). Filtre a solução.
   2. Remover o meio de cultura completo e lavar as células com 3 ml de PBS.
   3. Incube as células com 2 ml de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,05% (para uma placa de Petri de 6 cm) por 5 min a 37 ° C, 5% de CO₂ e desconecte as células usando uma pipeta.
   4. Inative a tripsina adicionando 2 ml de DMEM e colete as células por centrifugação a 300 x g por 5 min.
   5. Remover o sobrenadante, adicionar 1 ml de DMEM ao sedimento e pipetar a solução para cima e para baixo o suficiente para dispersar as células numa suspensão unicelular.
   6. Dividi-los 1:4 em uma nova placa de Petri de 6 cm de diâmetro contendo 3 ml de meio completo. Manter as células em cultura em placas de Petri de 6 cm de diâmetro a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5%. Subcultura uma vez por semana, ou quando cobrirem 80 - 90% da área de superfície.
2. Revestimento celular SH-SY5Y para imagem
   1. Para experimentos TIRFM, as células da placa são colocadas em tampas de vidro. Empregue tampas de vidro com 0,17 ± 0,005 mm de espessura e um índice de refração de 1,5255 ± 0,00015. Antes de começar, prepare as lamínulas de vidro da seguinte forma:
      1. Limpe as tampas de vidro com etanol a 90% durante a noite (O/N).
      2. Enxágue-os bem em água destilada (três trocas de água destilada). Seque as tampas de vidro em um forno de secagem.
      3. Coloque as tampas em placas de Petri de vidro e esterilize em forno pré-aquecido a 200 °C por 3 horas.
   2. No dia anterior à transfecção, colocar cada lamínula numa placa de Petri de 3,5 cm, adicionar 1 ml de meio de cultura e incubar a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5%.
   3. Tripsinize as células conforme descrito nas etapas 1.1.3 - 1.1.5, suspenda o pellet celular em 1 ml de meio completo e conte. Calcule o volume correto de suspensão celular para adicionar a cada placa de Petri para produzir 3 x 10⁵ células/poço. Essa densidade é necessária para o crescimento celular ideal e a transfecção eficiente. Incubar a 37 °C em uma incubadora de CO₂ a 5% O/N.
3. SH-SY5Ytransfecção por polietilenimina (PEI)
   NOTA: Para visualizar a dinâmica das vesículas sinápticas, foi utilizado um vetor pCB6 contendo sinapto-pHluorina. A sinapto-pHluorina foi gerada pela fusão no quadro de uma variante sensível ao pH da proteína fluorescente verde (GFP) e da proteína da membrana vesicular sinaptobrevina 2. A construção tem sido extensivamente empregada para investigar as propriedades das vesículas sinápticas dentro dos neurônios.
   1. Antes de iniciar a transfecção, faça 10 ml das seguintes soluções. Manter as soluções por no máximo 1 mês.
      1. Faça uma solução de NaCl de 150 mM. Ajuste para pH 5,5 com ácido clorídrico (HCl) 0,01 N.
      2. Faça uma solução de PEI a 10% de polietilenimina (PEI; 25 kDa linear) em solução de NaCl 150 mM. O pH da solução sobe para 8,8. Ajuste o pH para 7,8 com HCl 0,01 N.
   2. 24 horas após o revestimento, remova o meio e atualize com 1,5 ml de meio completo. Manter as células a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5%.
   3. Sob o gabinete de biossegurança de fluxo laminar, em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicione 3 μg de DNA de plasmídeo a 25 μl de solução de NaCl 150 mM e 100 μl de solução de PEI por placa de Petri de 3,5 cm.
   4. Vortex por 10 segundos e, em seguida, incube a mistura DNA / PEI por 30 min em temperatura ambiente (RT).
   5. Adicione cuidadosamente a mistura de DNA / PEI à placa de Petri contendo lamínulas com células e agite suavemente para distribuir igualmente o reagente na placa de Petri.
   6. Após 4 h, mudar o meio e incubar as células O/N a 37 °C numa incubadora de CO₂ a 5%. Realize experimentos de imagem 24 a 48 h após a transfecção.

2. Cell Imaging by TIRFM

1. Imaging set-up
   1. Realize a imagem TIRF com a configuração descrita na Figura 1. É composto por um microscópio invertido motorizado (Figura 1, inserção A), a fonte de laser (Figura 1, inserção B) e o controle deslizante TIRF (Figura 1, inserção C). Alcance a iluminação TIRFM através de uma objetiva de imersão com óleo de alta abertura numérica (NA 1.45 Alpha Plan-Fluar) 100X.
   2. Para iluminação TIRFM, empregue um laser de íons de argônio de 100 mW de várias linhas (458/488/514 nm). Usando uma fibra monomodo, introduza a luz laser polarizada linearmente no caminho do feixe por meio do controle deslizante TIRF. Insira o controle deslizante TIRF no plano do diafragma do campo luminoso do caminho do feixe de luz refletida.
      1. Para iluminação de campo amplo, conecte o microscópio a uma lâmpada de arco curto de mercúrio convencional HBO luz branca. Um prisma duplo de manutenção de polarização no controle deslizante garante a combinação simultânea de iluminação TIRF e luz branca.
   3. Filtre a luz do laser com um filtro de excitação (largura de banda 488/10 nm) montado em uma roda de filtro e introduzido no caminho do laser. Empregue um obturador de alta velocidade controlado por software para permitir o controle rápido da iluminação do laser. Para análise de pHluorina, montar um filtro de emissão passa-banda de 525/50 nm. Capte imagens digitais (512 x 512 pixels) numa câmara Fast CCD refrigerada com o software Image ProPlus.
2. Obtendo a iluminação TIRF (Figura 2)
   1. Ligue os lasers, o computador, a câmera, a roda do filtro e os controladores do obturador; em seguida, aguarde 20 minutos antes de iniciar o experimento, pois os lasers precisam aquecer e estabilizar.
   2. Antes de fazer a imagem, faça o volume oportuno das seguintes soluções.
      1. Fazer 50 ml de solução de Krebs (KRH) a 125 mM de NaCl, 5 mM de cloreto de potássio (KCl), 1,2 mM de sulfato de magnésio (MgSO₄), 1,2 mM de di-hidrogenofosfato de potássio (KH₂PO₄), 25 mM de ácido 4-(2-hidroxietil) piperazina-1-etanossulfônico (HEPES) (tamponado a pH 7,4), 2 mM de cloreto de cálcio (CaCl₂) e 6 mM de glicose.
      2. Faça 10 ml de solução KCl-KRH (pH 7,4) a 80 mM de NaCl, 50 mM de KCl, 1,2 mM de MgSO₄, 1,2 mM de KH₂PO₄, 25 mM de HEPES (tamponado a pH 7,4), 2 mM de CaCl₂ e 6 mM de glicose.
   3. Remova a tampa de vidro com células transfectadas e insira-a na câmara de imagem apropriada. Monte a câmara e adicione 500 μl de solução de KRH no centro do vidro.
   4. Adicione óleo sobre a objetiva. Coloque a câmara de imagem no palco do microscópio e posicione a objetiva sob a lamínula de vidro. Posicione a tampa do cofre sobre a amostra.
   5. No modo de epifluorescência, concentre-se na lamínula (superfície superior) e escolha as células transfectadas colocadas no centro da câmara. Selecione células cujo sinal fluorescente possa ser claramente registrado usando um tempo de exposição abaixo de 80 mseg.
   6. Sob o controle do software, mude para a iluminação TIRF no modo ao vivo.
   7. Para definir a configuração TIRF, verifique a posição do feixe que emerge da objetiva na tampa da amostra (Figura 2B). Quando o feixe é posicionado no centro da lente objetiva (Figura 2A, esquerda), um ponto é visível no centro da tampa da amostra TIRF (Figura 2B, esquerda) e a célula é visualizada no modo de epifluorescência (vários planos de foco, alta fluorescência de fundo; Figura 2C, esquerda).
   8. Para alcançar o ângulo crítico, mova o ponto focalizado na direção Y (para frente ou para trás; Figura 2B, centro) usando o parafuso de ajuste de ângulo no controle deslizante TIRF (Figura 1C). Quando o feixe converge no plano da amostra em um ângulo maior que o ângulo crítico (Figura 2A, à direita), a mancha desaparece e uma linha reta, fina e focada é evidente no meio da tampa da amostra (Figura 2B, à direita).
   9. Para ajustar o ângulo TIRF, use a amostra de célula (Figura 2C). Assista à imagem de fluorescência no vídeo. Nesta fase, uma imagem semelhante à epifluorescência ainda é visível. Mova suavemente o parafuso até que a condição TIRF seja alcançada: apenas um plano óptico da célula está em foco (ou seja, a membrana plasmática em contato com a lamínula). Isso resulta em uma imagem plana com alto contraste (Figura 2C, à direita).
3. Exemplo de imagem
   1. Defina o experimento de lapso de tempo de canal único. Para minimizar o fotobranqueamento, capture a imagem usando um baixo tempo de exposição e alto ganho. Os tempos de exposição apropriados estão entre 40 e 80 mseg. Adquira imagens na frequência de amostragem de 1 a 2 Hz. A cinética da vesícula pode ser melhor apreciada na amostragem em frequência mais alta (10 Hz). O tempo regular de observação é geralmente de 2 min.

Results

Figura 1. Microscópio TIRF configurado. Vista esquemática e imagem (inserção) do sistema de microscópio TIRF. A configuração compreende o microscópio invertido motorizado Axio Observer Z1 (A), um laser de íons de argônio de 100 mW de várias...

Materials