Microinjeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação gênica em um filhote de camundongo estriado

Resumo

Fonte: Chen, S., et al., Cirurgia Estereotáxica para Manipulação Genética em Células Estriatais de Cérebros de Camundongos Neonatais. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a injeção estereotáxica de um vetor viral que codifica a Cre recombinase e a proteína de fluorescência verde ou GFP no estriado de um filhote de camundongo geneticamente modificado para obter a manipulação de genes extirpando um STOP flanqueado por loxP, ativando a proteína de fluorescência vermelha ou RFP como repórter.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Microinjeção

1. Prepare a cirurgia estéril limpando bem o instrumento estereotáxico com etanol a 70%. Mergulhe o instrumento cirúrgico em etanol a 70% para esterilizá-lo.
2. Esfregue a cabeça do filhote com etanol 70%. Localize o lambda de referência no crânio e marque o lambda com uma caneta marcadora. Aponte a ponta da agulha para o lambda e defina as coordenadas ântero-posterior (AP) e médio-lateral (ML) como zero.
3. Mover o braço de injeção para o local de destino de acordo com as coordenadas X e Y do local de destino. Para o estriado dos filhotes do dia pós-natal (P) 2, as coordenadas são: AP, +2,4 mm anterior ao lambda; ML, ±1,0 mm lateral da linha média; dorsal-ventral (DV), −1,7 mm do crânio. Marque a posição do corante verde rápido no tubo PE10 com uma caneta.
4. Abaixe a agulha de injeção 30G lentamente para penetrar na pele e no crânio e, em seguida, levante a ponta da agulha até que ela pare na superfície do crânio. Defina a coordenada DV como zero.
5. Lentamente, abaixe a agulha de injeção de 30G até atingir a coordenada DV do local alvo. Aguarde 1 min para permitir que o parênquima retome sua forma normal. Em seguida, execute o programa de microinjeção (100 nL/min).
6. Certifique-se de que a marca do corante verde rápido esteja se movendo no tubo PE para garantir que o líquido do vírus seja injetado no cérebro.
7. Aguarde 1 minuto após o término da microinjeção e, em seguida, leve a agulha lenta e progressivamente até 1/2 da altura da profundidade do DV em 30 s. Após 30 s, retire lentamente a agulha da cabeça do filhote.

2. Recuperação pós-cirúrgica do filhote

1. Aqueça o filhote por 20 min em uma incubadora a 33 °C. Verifique a recuperação do filhote da anestesia por hipotermia a cada 5 minutos até que o filhote recupere a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
2. Devolva o filhote à barragem depois que ele estiver totalmente recuperado.

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