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1. Imagem de eventos exocíticos via microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF)
Nota: Este protocolo requer equipamento de microscopia especializado, incluindo uma câmara ambiental para manter temperatura, umidade e dióxido de carbono (CO2), um microscópio de fluorescência de reflexão interna total invertida (TIRF) equipado com uma iluminação epifluorescente, uma objetiva TIRF de alta ampliação/alta abertura numérica (NA), um XYZ automatizado e um detector de dispositivo de carga acoplada (CCD) sensível. Este protocolo usa um microscópio invertido totalmente automatizado equipado com uma objetiva TIRF de 100x 1,49 NA, um laser de estado sólido de 491 nm e um CCD multiplicador de elétrons (EM-CCD). Todos os equipamentos são controlados por software de imagem e controle a laser. Antes do início do protocolo de imagem, ligue a câmara ambiental, a platina, a lâmpada, o computador e a câmera.
- Selecione a objetiva no software de imagem. Assim que a objetiva estiver no lugar, prenda o aquecedor da objetiva ao redor do colarinho.
- Confirme se a objetiva está totalmente abaixada antes de prender a incubadora de palco no slot de palco. Despeje água destilada uniformemente nas entradas da incubadora do estágio para evitar derramamentos.
- Ligue o sistema de incubação. Abra a válvula do tanque de CO2 e confirme se a pressão é apropriada para o sistema de acordo com as instruções do fabricante. Aguarde algum tempo para que a câmara atinja 5% de CO2 e 37 °C. Antes de adicionar a placa de imagem, coloque uma placa vazia na incubadora para evitar a condensação de água na objetiva.
- Ligue a fonte de laser.
- Abra a incubadora de platina e adicione óleo de imersão à lente. Coloque a amostra na incubadora e estabilize-a com braços de estabilidade ou um peso de prato. Levante a objetiva até que o óleo entre em contato com o fundo da amostra. Mude para iluminação de luz transmitida e encontre o plano focal neuronal através das oculares.
- Inicie o software do laser e conecte-o ao software de controle do laser. Defina a iluminação para campo amplo e selecione a objetiva (recomenda-se 100x 1.49 NA TIRF). Defina o índice de refração da amostra (células ~1,38). Ajuste a intensidade do laser desmarcando "TTL" (Transistor-Transistor Logic) para o laser de 491 nm. Ajuste o controle deslizante para 100 e, em seguida, abaixe-o novamente para um valor entre 20% e 40%. Verifique novamente "TTL".
- Foque a amostra novamente na iluminação de luz transmitida. Vá para o software de imagem, selecione a iluminação a laser de 491 nm e abra o obturador. Ajuste o ponto focal do laser no teto e centralize-o no centro do diafragma de campo fechado com o condensador removido. Coloque o condensador de cabeça para baixo na bancada óptica para não arranhar a lente.
- Substitua o condensador, vá para o software TIRF e defina a profundidade de penetração (PD) para 110 nm. Em seguida, mude da iluminação de campo amplo para o modo de iluminação TIRF para geração de imagens.
- Encontre células que expressam a proteína de membrana 2 associada à vesícula (VAMP2) através das oculares usando epifluorescência de campo amplo com a fonte de luz epifluorescente.
- Ajuste os parâmetros de imagem (tempo de exposição, ganho e potência do laser) para maximizar a relação sinal-ruído e a faixa dinâmica usando o tempo mínimo de exposição e a intensidade do laser para reduzir o fotobranqueamento e a fototoxicidade (por exemplo, exposição entre 50 - 100 ms, com um ganho de 15 a 30 a 30% da potência máxima do laser).
- Defina o foco automático contínuo por célula. Adquira um conjunto de imagens de lapso de tempo com aquisição ocorrendo a cada 0,5 segundos por 5 min. Para a condição estimulada com netrina-1, adicione 500 ng/ml de netrina-1 à placa de células em uma capela de fluxo laminar e retorne a placa à incubadora por 1 hora antes da imagem.