Microscopia de Fluorescência de Reflexão Interna Total para Visualização de Eventos Exocíticos

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Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonte: Winkle, C. C., et al. Utilizando metodologias combinadas para definir o papel da entrega da membrana plasmática durante a ramificação do axônio e a morfogênese neuronal. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) para visualizar eventos exocíticos em neurônios corticais. Um marcador de proteína fluorescente verde (GFP) sensível ao pH fluoresce após a fusão da vesícula, com excitação seletiva de TIRF capturando exocitose proximal da membrana em imagens de lapso de tempo.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Imagem de eventos exocíticos via microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF)

Nota: Este protocolo requer equipamento de microscopia especializado, incluindo uma câmara ambiental para manter temperatura, umidade e dióxido de carbono (CO₂), um microscópio de fluorescência de reflexão interna total invertida (TIRF) equipado com uma iluminação epifluorescente, uma objetiva TIRF de alta ampliação/alta abertura numérica (NA), um XYZ automatizado e um detector de dispositivo de carga acoplada (CCD) sensível. Este protocolo usa um microscópio invertido totalmente automatizado equipado com uma objetiva TIRF de 100x 1,49 NA, um....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm placas de imagem de células vivas com fundo de vidro	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	Deve ser revestido com 1mg/mL de poli-D-lisina e enxaguado antes do revestimento das células
Microscópio invertido Olympus IX81-ZDC2	Olympus
Lambda LS lâmpada de xenônio	Sutter Instruments Company
Incubadora superior de estágio ambiental	Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF objetivo	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Cell TIRF software de controle	Olympus		Software usado para controlar lasers para imagem TIRF
Fiji (Imagem J)	NIH	ImageJ versão 1.49t
Coelho policlonal anti-humano VAMP2	Sinalização celular	11829
Poli-D-lisina	Sigma	p-7886	Dissolvido em água estéril a 1mg/mL

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