Inibição da atividade neuronal e sua detecção usando eletrofisiologia em um rato

Resumo

Fonte: Lai, J., et al. Registro eletrofisiológico simultâneo e microinjeções de agentes inibitórios no cérebro de roedores. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra uma técnica baseada em microinjeção para registro e inibição neuronal simultânea no colículo superior de ratos. O procedimento envolve direcionamento estereotáxico, perfuração do crânio e a inserção de um injetor, que fornece um neurotransmissor inibitório enquanto registra a atividade neuronal. A estimulação da luz evoca potenciais de ação, enquanto a microinjeção de drogas suprime a excitabilidade neuronal. À medida que os níveis de neurotransmissores diminuem, a atividade neuronal retorna à linha de base, permitindo o estudo da inibição e da recuperação.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Montagem da pipeta de injeção de gravação

1. Puxe um capilar de vidro de aproximadamente 7 cm de comprimento (1 mm de diâmetro externo) usando um extrator de pipeta.
2. Quebre a ponta do capilar e verifique a abertura sob um microscópio de luz. Confirme se o diâmetro interno está entre 30 μm e 40 μm.
3. Insira um fio de prata de 7 cm de comprimento no capilar de vidro com aproximadamente 1 cm saliente da extremidade não cônica da pipeta de vidro.
4. Dobre o excesso de filamento ortogonalmente ao capilar de vidro.
5. Aplique uma gota de adesivo plástico flexível na haste de uma agulha hipodérmica de 30 G.
6. Insira uma agulha hipodérmica de 30 G na pipeta de vidro de acordo com os esquemas apresentados na Figura 1.
7. Adicione uma segunda camada de cola para garantir uma vedação adequada da junção entre a pipeta de vidro e a agulha hipodérmica.
8. Deixe a pipeta secar com a ponta voltada para cima por cerca de 12 horas para garantir a cura adequada da cola. O resultado final é mostrado na Figura 2.

NOTA: Este procedimento é feito em experimentos agudos e a esterilização da ponta da pipeta não é necessária.

2. Preparação Animal

1. Coloque o rato em uma caixa de anestesia.
2. Induzir a anestesia com isoflurano a 4% por 5 a 10 min.
3. Coloque o animal em uma mesa estereotáxica com uma almofada de aquecimento e uma sonda retal para manter uma temperatura corporal de 37 °C. Use um cone nasal para manter a anestesia com isoflurano a 2%. Prenda a cabeça do rato usando barras auriculares e um suporte de dentes.
4. Aplique pomada oftálmica ou colírio, que incluem gotas de atropina a 1% para ajudar na dilatação da pupila. Para evitar o ressecamento, aplique gotas lubrificantes aproximadamente a cada 30 min.
5. Raspe a cabeça e limpe-a com 10% de iodopovidona.
6. Para anestesia local, injete 0,5 ml de lidocaína a 2% sob o couro cabeludo em 2-3 locais, levantando a pele e inserindo a ponta da agulha.
7. Confirme um nível adequado de anestesia realizando uma pinça no dedo do pé e observando a falta de movimento. Além disso, monitore a frequência cardíaca para garantir que esteja dentro dos valores normais (300 a 400 batimentos/min).
8. Incise o couro cabeludo em linha reta ao longo da mediana com uma lâmina de bisturi #10 para expor as suturas coronal e sagital.
9. Revele os pontos Lambda e Bregma afastando o tecido que cobre o crânio com uma espátula cirúrgica.
10. Nivele o crânio de modo que as posições Bregma e Lambda fiquem no mesmo plano.
11. Para definir o ponto de referência, use um dispositivo estereotáxico com um tubo de vidro montado para colocá-lo logo acima de Bregma. Este será o "zero" para as coordenadas de medidas ântero-posterior e médio-lateral.
12. Defina o ponto de interesse movendo a montagem estereotáxica para as coordenadas necessárias, observe as coordenadas estereotáxicas e desenhe um quadrado ao redor da área alvo que marca onde a craniotomia será realizada.
13. Use uma broca cirúrgica com uma broca esterilizada ao longo do quadrado marcado lentamente, sem pressão, para remover lentamente o material ósseo. Tenha cuidado para não perfurar por muito tempo na mesma área, pois isso produzirá calor e causará lesões no córtex.
14. Quando o osso que delimita a craniotomia se tornar suficientemente fino, remova cuidadosamente a seção craniana com uma pinça para expor o córtex.
15. Freqüentemente, irrigue o córtex exposto com líquido cefalorraquidiano artificial para evitar a dessecação do tecido.
    NOTA: A remoção da dura-máter é desnecessária no rato, pois a ponta do injetor é resistente o suficiente para penetrar.

3. Enchimento e montagem do sistema de injeção Encha

1. a microsseringa de 5-10 μl por aspiração com óleo mineral.
2. Encha a agulha hipodérmica com a pipeta de vidro fixa com uma solução de Chicago Sky Blue (CSB) a 0,5% e ácido γ-aminobutírico (GABA) a 300 μM ou uma solução de lidocaína a 2% com CSB a 0,5%. Dilua todas as soluções com solução salina.
   1. No caso de uma substância abundante, encha com uma seringa comum e use as técnicas de precaução usuais para evitar a formação de bolhas de ar.
   2. No caso de substâncias mais caras, use óleo mineral para encher a injeção e o agente químico pode então ser introduzido por aspiração. Como a diferença de densidade entre óleo mineral e água é relativamente alta, essa substância é uma boa candidata para a injeção de soluções aquosas.
      NOTA: Um corante pode ser adicionado para confirmar a separação entre dois líquidos.
3. Para encher a pipeta de injeção, encha uma seringa de 1 ml com a solução por aspiração e, em seguida, injete lentamente a solução na pipeta de injeção.
4. Preste muita atenção aos vazamentos nas regiões indicadas na Figura 1, limpando essas áreas e observando os vazamentos, injetando a solução lentamente com a seringa.
5. Retire a seringa de 1 ml. Ao fazer isso, certifique-se de manter uma leve pressão no êmbolo para que o vácuo não remova a solução da pipeta de injeção.
6. Encha a microsseringa com óleo mineral por aspiração e fixe-a firmemente à pipeta de injeção cheia, depois limpe cuidadosamente qualquer excesso de solução da injetora montada com gaze.
7. Verifique se a ponta não está bloqueada injetando um volume muito pequeno, o suficiente para ver uma pequena gota se formando na ponta da pipeta de vidro.
8. Monte o injectrode no sistema de microbomba e certifique-se de que está bem fixado.
9. Posicione cuidadosamente a ponta injetada nas coordenadas alvo e abaixe a ponta até a superfície do córtex.
10. Abaixe lentamente o injetor usando o aparelho estereotáxico até a estrutura alvo (colículo superior neste caso) usando as coordenadas anatômicas apropriadas.
11. Cubra o córtex exposto com ágar quente para evitar a dessecação do tecido.

4. Injeção e Inativação Reversível

1. Defina a bomba de microinjeção para injetar 400 a 800 nl a 40 nl/min e pressione Executar para iniciar a injeção. Observe que a taxa de pico mostrará uma redução durante a injeção.
   NOTA: Na configuração experimental, a atividade neural se recuperou dentro de uma hora após o término da administração do GABA. Qualquer dispositivo mecânico calibrado pode ser usado para aplicar pressão na seringa de microinjeção para realizar a injeção.
2. Após a aquisição dos dados eletrofisiológicos, eutanasiar usando um método aprovado pelo Comitê de Ética Animal local.

Resultados

Figura 1: Representação esquemática do conjunto injectrode. Uma microseringa (A) é conectada à pipeta de registro-injeção, que consiste em uma agulha hipodérmica de 30 G (B) aderida a um fio de prata (...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bomba de injeção (UltraMicroPump III)	WPI	#UMP3
Console de injeção (Micro4 Controller)	WPI	#SYS-MICRO4
Seringa Hamilton	Hamliton	(80301) 701LT 10 μL SYR	Seringas entre 5 e 10 μL usadas
Adesivo de cianoacrilato em gel	Krazy Glue	KG86648R	A forma de gel é mais fácil de aplicar na haste da agulha hipodérmica 30G
Pipetas de vidro	WPI	#TW100F-4	Parede fina, 1mm OD, 0,75mm ID com pipetas de filamento usadas
720 Extrator de pipeta de agulha	Kopf	720
Fio de prata	A-M Systems, Inc.	782500	0,010 " desencapados