Entrega de genes subpiais na medula espinhal de camundongos para avaliar a expressão gênica

Resumo

Fonte: Tadokoro, T., et al. Entrega do vetor do vírus adeno-associado subpial 9 (AAV9) em camundongos adultos. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra uma técnica de injeção subpial para entrega de genes à medula espinhal em camundongos. O procedimento envolve expor a dura-máter, perfurar a pia-máter e injetar um vírus adeno-associado recombinante (rAAV) carregando um gene que expressa proteína fluorescente no espaço subpial. Após a injeção e recuperação, o vírus facilita a expressão gênica nas células da medula espinhal, permitindo o estudo da expressão gênica alvo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Preparação geral de animais e cirurgia

1. Antes de iniciar o procedimento cirúrgico, descongele o vírus (AAV9-UBI-GFP [UBI: Ubiquitin Promoter, GFP: Green Fluorescent Protein]; alíquotas de 5 μL). Prepare uma solução de dextrano a 5% (10.000 MW) misturando o pó de dextrano em água destilada. Misture a solução do vírus com solução de dextrano a 5% 1:1 até uma concentração final de dextrano de 2,5%.
   1. Armazenar a solução do vírus no gelo (4 °C).
2. Use camundongos C57BL / 6J adultos (machos e fêmeas, 20-30 g). Anestesiar os camundongos com isoflurano a 5% (em O₂, 1 L/min) e mantê-los a 2-3% de isoflurano inalado (em O₂, 1 L/min) pelo cone nasal durante a cirurgia, dependendo da frequência respiratória e da resposta ao beliscão da pata.
3. Raspe as costas dos animais com uma tesoura de barbear e limpe a pele com clorexidina a 2%.
4. Em estudos de recuperação crônica, siga uma técnica estéril estrita.
5. Se forem realizadas injeções subpiais lombares, corte a pele que cobre as vértebras Th8-L1 com um bisturi e retire o músculo paravertebral das vértebras da coluna Th10-12 usando uma tesoura.
   1. Monte o animal em uma estrutura estereotáxica padrão usando grampos espinhais de camundongo.
   2. Raspe ambos os lados da lâmina das vértebras Th10-12 usando uma broca odontológica (broca: 0,9 mm, velocidade: 20.000 rpm) até que apareçam rachaduras.
   3. Remova fragmentos ósseos trincados com uma pinça e exponha a superfície dorsal da medula espinhal lombar.
   4. Corte a dura-máter cerca de 1 cm com uma agulha de aço inoxidável 30 G e uma pinça.

2. Abrindo a membrana pial e inserindo a agulha subpial para entrega AAV9

1. Monte a agulha de penetração de 34 G pia no braço em Z de um manipulador XYZ usando um suporte capilar de vidro (Figura 1A e B).
   NOTA: Para fabricar a agulha de penetração de pia, a ponta chanfrada original da agulha 34G é afiada usando um chanfrador capilar de vidro com placa abrasiva de diamante - grossa (ponta de 5,0 μm a 50 μm tamanhos) e ângulo de moagem de 15 - 20°. A ponta da agulha (1 mm de comprimento, medido a partir da ponta) é então suavemente dobrada a cerca de 90° (Figura 1B, inserção à esquerda).
2. Usando um escopo de dissecação cirúrgica, ajustado para aumento de 8-10X, penetre o pia com a agulha de penetração pia em cerca de 1 mm (Figura 1C) usando o braço em X.
   1. Mantenha o ângulo da agulha penetrante na superfície do tecido em 5-10°.
3. Após a abertura da pia, remova a agulha de penetração da pia horizontalmente do espaço subpial (Figura 1D) usando o braço em X.
   NOTA: Lembre-se do local penetrado por um ponto de referência, como um vaso sanguíneo.
4. Carregue uma agulha de injeção 36G romba com o vírus AAV9-UBI-GFP usando uma microsseringa de 50 μL conectada à agulha de injeção com tubo PE-10 ou PE-20.
5. Monte a agulha no braço Z de um segundo manipulador XYZ (Figura 1A e B) usando um suporte capilar de vidro (Figura 1B, inserção direita).
   NOTA: Para fabricar a agulha de injeção subpial AAV9, a ponta romba de uma agulha 36 G é polida usando um chanfrador capilar de vidro com placa abrasiva diamantada - grossa (tamanhos de ponta de 5,0 μm a 50 μm) para remover as bordas afiadas. A ponta da agulha (2-3 mm de comprimento, medido a partir da ponta) é então suavemente dobrada a cerca de 90°. As agulhas de injeção pia-penetrante e subpial são inseridas em tubos de aço inoxidável escravo 20G de 1-2 cm de comprimento (10 mm da extremidade da agulha) e coladas com epóxi. O uso de tubos de 20 G (0.91 mm de diâmetro) é necessário para uma fixação segura ao suporte capilar de vidro.
6. Manipulando os braços X, Y e Z do segundo manipulador, posicione a ponta da agulha de injeção AAV9 no local pia penetrado e, em seguida, avance-a cerca de 2-3 mm no espaço subpial através da abertura anterior da membrana pial usando o braço em X (Figura 1E e F).
   NOTA: 1) O AAV9-UBI-GFP é preparado de acordo com protocolos relatados anteriormente, e os títulos finais são ajustados para 1,2 x 10¹³ cópias do genoma por mL (gc/mL). 2) Não há necessidade de marcar o local da abertura pial, pois é facilmente identificável (Figura 1D).
7. Injete o AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 ou 5 μL) no espaço subpial usando uma microsseringa de 50 μL (consulte a Tabela 1 para grupos experimentais).
8. Remova a agulha de injeção do espaço subpial após a conclusão da injeção de AAV9-UBI-GFP.
9. Feche o músculo e a pele com sutura monofilamentar 4.0 e clipes cirúrgicos.
   OBS: Não há necessidade de selar a vértebra aberta.
10. Deixe os animais se recuperarem em uma almofada de aquecimento.
11. Para controle da dor, injete buprenorfina 0,05 mg / kg / sc a cada 12 h por 2-3 dias após a cirurgia.

Tabela 1: Grupos experimentais. Todos os experimentos foram realizados em camundongos C57BL/6J adultos.

Grupos Experimentais	Local/nível de administração de AAV9 (*)	Volume de AAV9 inj, taxa de infusão	Tempo de sobrevida	Análise tecidual
Grupo A (n = 7)	C2 (bilateral)	5 μL/5 min	14 dias	Cérebro + medula espinhal
Grupo B (n = 12)	L1-L2 (bilateral)	1,5 μL ou 3μL, 60 seg/μL	14 dias	Cérebro + medula espinhal
Grupo C (n = 6)	C2 + L1-L2 (bilateral em cada nível)	5 μL/5 min	14 dias	Medula
* - bilateral = duas injeções subpiais, uma administrada no espaço subpial direito e outra no espaço subpial esquerdo do(s) segmento(s) injetado(s).

espinhal

Resultados

Figura 1: Configuração experimental para realizar injeções subpiais espinhais em um camundongo adulto. (A) Para realizar injeções subpiais espinhais em camundongos adultos, dois manipuladores XYZ separados sã...

Materiais

< >< table class = 'ck-table-resized'> < col style = 'width: 25%;'>Lista de materiais utilizados neste artigo Nome Empresa Número de catálogo Comentários C57BL / 6J RatosJackson Labs664 Estereotáxico padrão de laboratório para camundongosHarvard Apparatus72-9568 Mouse Spinal AdaptorHarvard Apparatus72-4811 Manipulador XYZStoelting51604 Bomba de Infusão ManualStoelting51218 34G Agulha Nanofill chanfradaWorld Precision InstrumentsNF34BV-2 36G Agulha Blunt NanofillWorld Precision InstrumentsNF-36BL-2 Fluriso, IsofluranoMWI Veterinary Supply502017 Solução de clorexidinaMWI Veterinary Supply501027 Agulha de aço inoxidável 20GBecton-Dickinson305175 Agulha de aço inoxidável 23G Agulha de aço inoxidável Becton-Dickinson305145 30GBecton-Dickinson305128 aplicador com ponta de algodãoMWI Veterinary Supply27426 Chanfrador Capilar de VidroNarishige InternationalSM-25B Microscópio de Lâminas SuperfrostLeica MicrosystemsM80 50μl MicrosseringaHamilton81242 BD Intramedic PE-20 TubulaçãoBecton, Dickinson427406 BD Tubulação Intramedic PE-10Becton, Dickinson427401 4-0 sutura de monofilamentoVetOneV1D397 Chanfrador capilar de vidroNarishigePipet Micro Grinder EG-40 5 min Epóxi (Epóxi Transparente) Devcon14310 DextranPolysciences, Inc19411 AAV9-UBC-GFPLaboratório Central de Vetores Virais UCSD