Implantação de janela da medula espinhal em um camundongo para imagens in vivo

Resumo

Fonte: Pietruczyk, E. A., et al. Laminectomia e implantação de janela da medula espinhal no camundongo. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a implantação de uma janela da medula espinhal em um camundongo anestesiado para imagens in vivo. O protocolo estabiliza a medula espinhal exposta usando uma lamínula de borossilicato e uma placa traseira impressa em 3D. Este método permite a microscopia de dois fótons de alta resolução para estudar a dinâmica da barreira hematoencefálica e as interações neurovasculares.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Implantação da lamínula

1. Aplique suavemente uma lamínula de borossilicato de 3 mm no cordão exposto.
2. Certifique-se de que a agarose seja resfriada a 39 °C. Usando uma pequena espátula, aplique agarose/aCSF (líquido cefalorraquidiano artificial) quente a 2% na borda da lamínula e permita que a ação capilar a puxe para baixo da superfície.
   Nota: Em temperaturas abaixo de 39 °C, a agarose pode começar a gelificar. Se isso ocorrer, reaqueça em banho-maria ou micro-ondas. Alguns operadores preferem aplicar primeiro uma gota de agarose e colocar a lamínula por cima.
3. Aplique adesivo tecidual nos processos articulares ósseos expostos das vértebras adjacentes intactas na coluna vertebral do nível torácico 11 e na coluna vertebral do nível torácico 13. Aplique adesivo tecidual adicional em um anel ao redor do local da laminectomia, sobre o tendão adjacente e o processo transverso.
   Nota: O adesivo tecidual é necessário para a aderência adequada ao cimento dentário nas etapas subsequentes. Os processos articulares formam um assento natural no qual a placa traseira pode repousar de forma estável (Figura 1). A adesão aos processos articulares formará os pontos mais fortes de fixação.
4. Misture cimento dental com acelerador em uma bandeja de mistura de porcelana. Utilize uma pequena espátula para transferir cimento dental para a camada adesiva do tecido. Use cimento dentário para aderir a placa traseira ao campo cirúrgico centralizado sobre a janela. Aguarde 10 minutos para que o cimento dentário cure.
   Nota: A firme adesão da placa traseira aos processos articulares anterior e posterior fornece a estabilidade estrutural fundamental do implante.
5. Use cimento dental adicional para preencher a base interna da placa traseira e a parte inferior da placa traseira: interface do tecido.
   Nota: A aplicação extra de cimento dental melhora a aderência e reduz o risco de vazamento de fluido de imersão objetiva do microscópio (solução salina) pela parte inferior da placa traseira.
6. Avance o suporte da placa traseira bifurcada para a posição apropriada sobre a janela. Prenda a placa traseira no suporte da placa traseira com parafusos.
   Nota: Este protocolo utilizou um suporte de placa traseira usinado sob medida (Figura 2G\u2012H).
7. Aplique solução salina na placa traseira para testar se há vazamentos. Se algum fluido vazar, seque a área e aplique mais cimento dental.

2. Preparação da imagem

1. Transfira o animal para a plataforma cirúrgica para a mesa óptica.
   Nota: Nossa plataforma cirúrgica, suporte de placa traseira e suporte de cone nasal de isoflurano podem ser transportados entre estações cirúrgicas e de imagem de dois fótons como uma unidade durante a aplicação de anestesia contínua com isoflurano (Figura 2D, H). Unidades semelhantes podem ser montadas a partir de garfos de fixação, vigas e postes de pilares de suporte obtidos de fontes comerciais (por exemplo, ThorLabs). Para microscopia intravital, deve haver pelo menos 11 polegadas de folga entre a objetiva do microscópio e a mesa óptica para acomodar a altura da plataforma cirúrgica.
2. Fixe a plataforma cirúrgica na mesa óptica usando um poste de montagem de aço inoxidável e um garfo de fixação rebaixado.
3. Aplique solução salina fresca no poço da placa traseira. Abaixe uma lente de imersão em água no poço.
4. Use luz transmitida ou epifluorescência para identificar a área de interesse e foco. Mude para o modo de varredura a laser e realize imagens in vivo de acordo com o comprimento de onda de excitação do laser de dois fótons, filtros dicróicos e passa-banda apropriados para os fluoróforos presentes no tecido6.

Resultados

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Figura 1. Representação esquemática da colocação anatômica da janela da medula espinhal. A) Representação esquemática da visão superior de um corpo vertebral torácico inferior, processo espinhoso e segmento da me...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa traseira oval impressa em 3D	personalizada		Campo de imagem estabilizadora
Microscópio de dissecação cirúrgica	Leica	M205 C	Equipado com Leica FusionOptics, objetiva Planapo 0.63x série M e platina deslizante
Câmera para microscópio	Leica	MC170	Câmera colorida HD para visualização do campo cirúrgico
Platina deslizante	Leica	10446301	A platina deslizante é construída com duas placas de metal. A placa de base é fixa. A placa superior desliza na interface lubrificada para permitir o movimento rotacional e linear.
Estação cirúrgica e garfo de estabilização	Whale Manufactoring	personalizado	Laminectomia
SomnoSuite unidade de entrega de isoflurano de baixo fluxo	Kent Scientific	SS-01	Administração de anestesia cirúrgica com vaporizador digital integrado
Poste de montagem em aço inoxidável de 1,5 polegadas	ThorLabs	P50/M	Para montagem de estação cirúrgica em mesa óptica para imagem de
dois fótonsGarfo de fixação rebaixado para montagem de 1,5" Post	ThorLabs	PF175	Para estabilizar a montagem da estação cirúrgica em mesa óptica para imagem de dois fótons
Microbroca óssea ideal	Aparelho Harvard	72-6065	Osso desbaste para laminectomia
Banho-maria	Fisher Scientific	15-462-10	Aquecimento de solução salina
Pistola de cauterização	FST	18010-00	Cauterização de pequenos sangramentos
Almofada de aquecimento	Benchmark	BF11222	aquecedor de silicone de 1,9" x 4,5" com cabos de Teflon de 20", 10W, 5V
Sonda retal termoacoplada tipo K	Physitemp	RET3	Medição da temperatura corporal do rato
Vaselina	Sigma	8009-03-08	Sonda retal lubrificante
Controlador térmico regulado por feedback	personalizado	NA	As alternativas comercialmente disponíveis incluem a série Physitemp TCAT PVA
Lanças oculares cirúrgicas	Beaver-visitec international	40400-8	Aparador
elétrico	de sangue Wahl	41590-0438	Aparador de pele de rato
Lâmina, # 11	FST	14002-14	Fórceps de ferramenta cirúrgica
, # 5	FST	11254-20	Fórceps de ferramenta cirúrgica
, # 4	FST	14002-14	Ferramenta cirúrgica
Pinça dentada de titatnium	WPI	555047FT	Ferramenta cirúrgica
Tesoura de íris de titânio	WPI	555562S	Ferramenta cirúrgica
Adesivo de tecido Vetbond	3M	084-1469SB	Preparando a superfície do tecido para acrílico dental
Bandeja de mistura de cerâmica	Jack Richeson	420716	Agente acrílico dental de mistura com acelerador
Orthojet acrílico dental	Lang Dental	1520BLK, 1503BLK	Placa traseira de ligação permanente ao tecido
Vidro de cobertura redondo pequeno, espessura #1, 3 mm	óptica	do aparelho Harvard	64-0720
NaCl	Fisher Scientific	7647-14-5	Para aCSF
KCl	Fisher Scientific	7447-40-7	Para aCSF
Glicose	Fisher Scientific	50-99-7	Para aCSF
HEPES	Sigma	7365-45-9	Para aCSF
MgCl₂·6H₂O	Fisher Scientific	7791-18-6	Para aCSF
CaCl₂·2H₂O	Fisher Scientific	#################	Para aCSF
Carprofeno	Rimadyl	QM01AE91	Analgesia
Água bacteriostática	Henry Schein	2587428	Diluente para carprofeno
Isoflurano	Henry Schein	11695-6776-2	Anestesia
Solução de ringer com lactato	Baxter	0338-0117-04	Hidratação para camundongo
Agarose High EEO	Sigma	A9793	ponto de gel 34-37 graus C
Pomada lubrificante oftálmica	Akwa Tears	68788-0697	impedem o microscópio Sutter
			do Dois-Fóton da MOM

Janela da secagem da córnea