Monitoramento da expressão gênica em tempo real em fatias cerebrais por meio de imagens tridimensionais

Resumo

Fonte: Shimojo, H., et al. Imagem de bioluminescência em tempo real da dinâmica de sinalização Notch durante a neurogênese murina. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, culturas de fatias corticais de embriões de camundongos transgênicos são usadas para monitorar a expressão gênica por meio de imagens tridimensionais. Imagens de bioluminescência, fluorescência e campo claro são usadas para visualizar a expressão gênica em tempo real durante a diferenciação neuronal dentro do tecido nativo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

1. Visualização da expressão do repórter de luciferase em culturas de fatias
   1. Inicie o sistema de imagem ao vivo de luminescência antes de iniciar a dissecção. Utilizar as seguintes condições para as culturas em fatias corticais: 40% O₂, 5% CO₂ e 37 °C.
   2. Coloque o óleo de imersão na lente objetiva 40x. Coloque o prato de amostra no microscópio stage. Adquira a imagem de teste fluorescente e defina a posição e o plano de foco para a região de interesse sob a iluminação da luz de excitação.
   3. Execute a aquisição de lapso de tempo por aquisições tridimensionais (luminescência, fluorescência e campo brilhante) por 24 h (Figura 1F-H). Para aquisição de imagens de luminescência, use as seguintes configurações da câmera: baixa taxa de transferência (50 kHz), binning 2x2/4x4, tempo de exposição de 10 min/5 min. Para a aquisição de imagens de fluorescência e campo claro, use as seguintes configurações: taxa de transferência intermediária (1 MHz), binning 1x1 e tempo de exposição de 100 ms.

Resultados

Figura 1: Fazendo as fatias corticais do telencéfalo embrionário e visualizando a dinâmica da proteína Dll1 nas culturas de fatias corticais. (A) Verificação da expressão de EGFP usando um microscópio estereoscópico de fluorescência. A seta v...

Materiais

< >< tabela class='ck-table-resized'>Lista de materiais utilizados neste artigo Nome Empresa Número de catálogo Comentários Circulador de água gelada (chiller)JulaboModelo: F12-EDCâmera CCD refrigeradaAndor TechnologyModelo: iKon-M 934Sistema de incubadoraTOKAI HITModelo: INU-ONICSMicroscópio invertidoOlympusModelo: IX81Microscópio invertidoOlympusModelo: IX83Dispositivo de iluminação LEDCoolLEDModelo: pE1MetaMorphMOLECULAR DEVICESModelo: 40000Controlador de gás mistoTokkenModelo: TK-MIGM OLO2Lente objetivaOlympusModelo: UPLFLN 40X O