Fator de crescimento nervoso encapsulante em nanopartículas que imitam lipoproteínas de alta densidade

Resumo

Fonte: Zhu, J., et. al., Preparação e Caracterização de Novas Nanopartículas que Mimetizam HDL para Encapsulamento do Fator de Crescimento Nervoso. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a montagem passo a passo de nanopartículas que imitam HDL carregadas com NGF usando encapsulamento assistido por protamina e automontagem à base de lipídios para possíveis aplicações de entrega neurotrófica.

Protocolo

1. Preparação de nanopartículas que imitam NGF HDL

1. Dissolva os excipientes, fosfatidilcolina (PC), esfingomielina (SM), fosfatidilserina (PS), oleato de colesterol (CO) e succinato de polietilenoglicol D-α-tocoferol (TPGS), em etanol para preparar soluções estoque a 1 mg/mL.
   NOTA: As soluções estoque foram aliquotadas e armazenadas a -20 °C. O oleato de colesterol foi armazenado em frascos escuros. As soluções estoque de PC, SM, PS e CO permaneceram estáveis por até 6, 3, 12 e 12 meses, respectivamente, a -20 °C. A solução TPGS foi estável por pelo menos 12 meses a -20 °C.
2. Misture 10 μL de NGF (1 mg/mL em água) com 10 μL de protamina USP (1 mg/mL em água) em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e deixe repousar por 10 min em temperatura ambiente para formar o complexo.
   NOTA: As soluções estoque de NGF e protamina foram aliquotadas e armazenadas a -20 °C. Congelamento e descongelamento repetidos não são recomendados para o estoque de NGF.
3. Adicione 59 μL de PC, 11 μL de SM, 4 μL de PS, 15 μL de CO e 45 μL de TPGS a um frasco de vidro. Misture e evapore o etanol sob um fluxo suave de nitrogênio por cerca de 5 min; Todos os excipientes devem formar uma película fina e oleosa no fundo do frasco para injetáveis de vidro.
4. Adicione 1 mL de água ultrapura (tipo 1) ao frasco e homogeneize a 9.500 rpm (8.600 x g) por 5 min em temperatura ambiente para formar as nanopartículas protótipo (NPs).
5. Adicionar o complexo preparado no passo 1.2 aos NP protótipos e incubar a 37 °C durante 30 minutos com agitação utilizando uma pequena barra de agitação no frasco para injetáveis de vidro.
6. Resfrie os NPs mexendo em temperatura ambiente por mais 30 min. Depois que isso esfriar, adicione 106 μL de Apo A-I (1,49 mg / mL) e mexa em temperatura ambiente durante a noite para formar os NPs finais que imitam NGF HDL.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Recombinante Human Beta-NGF	Creative Biomart	NGF-05H
L-a-Fosfatidilcolina (PC)	Avanti	131601P	95%, Ovo, Frango
Esfingomielina (SM)	Avanti	860062P	Cérebro,
Fosfatidilserina suína (PS)	Avanti	840032P	Cérebro,
oleato de colesterol suíno (CO)	Sigma	C9253
D-α-Tocoferol succinato de polietilenoglicol (TPGS)	BASF	9002-96-4	Vitamina E Polietilenoglicol Succinato
Sulfato de protamina	Sigma	P3369	atende às especificações
de teste da USPApolipoproteína A1, plasma humano	Athens Research & Technology	16-16-120101	1mg em 671 μl 10 mM bicarbonato de amônio, pH 7.4
Homogeneizador	Tekmar	T 25-S1
Homogeneizador Polytron	Kinematica	PT 1200C