Entrega intravenosa de bloqueadores de receptores para reduzir o edema cerebral em um modelo de camundongo

Resumo

Fonte: Zeynalov, E. et. al., A infusão IV contínua é a via de tratamento de escolha para o bloqueador do receptor de arginina-vasopressina Conivaptan em camundongos para estudar o edema cerebral evocado por AVC. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a administração intravenosa de um antagonista do receptor de arginina-vasopressina (AVP) em um modelo de camundongo. A oclusão transitória da artéria cerebral média induz edema cerebral. Um antagonista do receptor AVP é administrado através de um cateter na veia jugular esquerda, aliviando o edema.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Indução de AVC In Vivo

1. Pré-revestir o filamento com resina dentária antes da cirurgia.
   1. Corte um pedaço de filamento de 12 mm de comprimento de uma sutura de náilon 7-0. Misture 2 partes da resina com 1 parte do endurecedor e, em seguida, mergulhe imediatamente a ponta do filamento na mistura para cobrir cerca de 1/3 de todo o comprimento. Remova-o rapidamente e verifique se está coberto com uma camada lisa de resina dentária.
   2. Seque o filamento ao ar por 2 horas antes de usar.
2. Coloque o camundongo em uma câmara de indução de anestesia (volume de 2 L) e defina o fluxo de isoflurano a 1,5% em ar ambiente enriquecido com oxigênio a 25% a 2 L/min entrando na câmara.
3. Deixe o mouse permanecer na câmara de indução até que esteja totalmente anestesiado, conforme determinado pela falta de resposta ao beliscão da cauda.
4. Coloque o mouse na mesa de operação com uma almofada aquecida e ajuste a concentração de isoflurano para 1% para manutenção da anestesia administrada espontaneamente através do cone nasal.
5. Prenda o cabelo na frente e na nuca e borrife o pescoço com álcool isopropílico. Aplique pomada oftálmica veterinária em ambos os olhos.
6. Para monitorar continuamente a temperatura corporal, use uma sonda de temperatura retal conectada a um display digital durante a cirurgia.
7. Coloque o mouse em decúbito dorsal, aplique solução esfoliante de iodopovidona a 10% para desinfecção, cubra com uma cortina estéril e, em seguida, faça uma incisão na linha média ao longo do pescoço com uma lâmina de bisturi cirúrgico tamanho 10.
8. Ligue temporariamente a artéria carótida comum esquerda (CCA) com uma sutura de seda 6.0.
9. Coloque outra amarração na artéria carótida externa esquerda (ECA).
10. Coloque um clipe microvascular na artéria carótida interna (ACI).
11. Corte um pequeno orifício na artéria carótida externa com uma tesoura microvascular. Insira um filamento feito de sutura de náilon 7-0 revestido com resina dentária na abertura do ECA e avance-o cefálico, enquanto remove o clipe, até sentir resistência (cerca de 5-7 mm do ponto de bifurcação do CCA).
12. Coloque uma amarração temporária na artéria carótida interna para prender o filamento na posição. Consulte o diagrama, Figura 1A. Feche a pele com uma sutura de seda e infiltre a ferida na frente do pescoço com 0,2 ml de bupivacaína a 0,5%, como no passo 2.6.
13. Permita que o camundongo desperte da anestesia e recupere a consciência em uma câmara de recuperação por 60 min. Não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
14. Teste o camundongo quanto à pontuação de déficit neurológico (NDS) da seguinte forma: 0 = função motora normal, 1 = flexão do tronco e do membro anterior contralateral na elevação da cauda, 2 = circulando para o lado contralateral, mas postura normal em repouso, 3 = inclinando-se para o lado contralateral em repouso, 4 = sem atividade motora espontânea.
    1. Para o teste NDS, levante o mouse pela cauda e coloque-o em uma superfície plana para observação (2-3 min). Como alternativa, observe os camundongos na câmara de recuperação. Exclua do experimento camundongos que exibem NDS menor que 2 devido à oclusão insuficiente da artéria carótida média (MCA).
       NOTA: A técnica de fluxometria a laser Doppler pode ser usada para confirmar a oclusão da ACM.
15. Reanestesiar o animal após 60 min de recuperação na câmara de indução conforme descrito acima, reesterilizar a incisão cutânea anterior com solução esfoliante de iodopovidona a 10% e reabrir a ferida cirúrgica na frente do pescoço cortando e removendo a sutura de seda.
16. Para remover o filamento do ECA, execute as seguintes etapas:
    1. Coloque um clipe microvascular no ICA. Desamarre a sutura no ICA e puxe o filamento para fora enquanto mantém o clipe aberto.
    2. Feche o clipe e coloque uma amarração no ECA proximalmente ao corte.
    3. Remova o clipe e a ligadura do CCA para restaurar o fluxo sanguíneo para o cérebro. Consulte o diagrama, Figura 1B.

2. Instalação do cateter intravenoso (IV) na veia jugular para tratamento contínuo de 48 horas

NOTA: Prossiga para a instalação do cateter imediatamente após a etapa 1.16.3 sem despertar o mouse.

1. Use dois tamanhos diferentes de tubo flexível: insira o tubo interno (0,94 mm de diâmetro externo; para conter o medicamento que está sendo infundido) no tubo externo (3,18 mm de diâmetro externo; para proteção do tubo interno).
2. Coloque o mouse em decúbito ventral, aplique a solução esfoliante de iodopovidona a 10% para desinfecção e faça uma incisão de 1 cm na nuca com uma lâmina de bisturi cirúrgico tamanho 10. Vire o mouse para a posição supina, esterilize novamente a frente do pescoço com solução esfoliante de iodopovidona a 10% e reabra a ferida cirúrgica na frente do pescoço. Passe o túnel do tubo sob a pele da incisão feita nas costas até a frente do pescoço e exteriorize-o da ferida aberta 1 cm.
3. Remova o tecido adiposo subcutâneo do lado esquerdo da frente do pescoço cerca de 1 cm lateralmente da linha média. Localize a veia jugular esquerda, coloque dois laços ao longo da veia com 5 mm de distância e estique levemente a veia. Faça um pequeno orifício na veia jugular entre os dois laços com uma tesoura microvascular; Insira a ponta do tubo interno com 5 mm de profundidade caudal (em direção ao coração).
4. Prenda o tubo com ambos os laços à veia jugular. Feche a pele na frente do pescoço com uma sutura de seda 3-0. Consulte o diagrama, Figura 1C.
5. Prenda o tubo à pele na parte de trás do pescoço com uma sutura e conecte o tubo a uma bomba de microinfusão IV por meio de um giro. O giro permite a livre circulação dos ratos dentro da gaiola com acesso total à comida e à água.
6. Infiltre as incisões cutâneas na frente e na nuca com 0,2 ml de bupivacaína a 0,5% para evitar dor pós-operatória.
   NOTA: Dependendo dos protocolos institucionais específicos para animais, os animais podem ser tratados com opioides, anti-inflamatórios não esteróides (AINEs) ou antibióticos no pré e pós-operatório. No entanto, os tratamentos mencionados podem alterar os resultados do desfecho do AVC isquêmico.
7. Permita que o animal desperte na câmara de recuperação e, em seguida, aloje-o em uma gaiola separada até o final do experimento. Não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal.
8. Defina a taxa de perfusão para tratamento IV contínuo de 48 horas de conivaptan (0,14 mg/ml em dextrose a 5%) ou veículo em 1,5 ml/kg/h, e inicie a perfusão.
   NOTA: A quantidade total de conivaptan com infusão intravenosa deve ser de aproximadamente 0,2 mg/ratinho/dia num volume total de 1,44 ml.

Resultados

Figura 1: Diagrama do modelo experimental de AVC, instalação do cateter IV e volume representativo do infarto 48 horas após o AVC. Posição do filamento (mostrado em azul) pré-revestido com resina (verde) na artéria carótida interna esquer...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Almofada aquecida	K&H Manufacturing Inc	1060
Monitor de temperatura com sonda retal	Physitemp	7029
Carretel de sutura de seda, 6-0	Surgical Specialties Corporation	SP114
Sutura de seda em agulha, 3-0	Ethicon	1684G
Sutura de nylon, 7-0	Ethicon	1696G
Resina dentária polissiloxano com endurecedor	Heraeus Kulzer	65817930
Bomba IV de microinfusão	Kent Scietific	GT0897
Giratório 22GA	Instech	375/22PS
Tubos de laboratório, 0,94 x 0,51 mm	Dow Corning	508-002
Tubos de laboratório, 3,18 x 1,98 mm	Dow Corning	508-009