A metilação do DNA: Modificação e Análise de bissulfito

Summary

O padrão ouro para a análise de metilação do DNA é sequenciamento genômico de DNA convertidos bissulfito. Este método tira vantagem do aumento da sensibilidade em comparação com 5 citosina-metilcitosina (5-MEC) para bissulfito de desaminação em condições ácidas. Citosinas não metiladas pode ser distinguida de citosinas metiladas após a amplificação do DNA genômico alvo.

Abstract

Epigenética descreve as mudanças hereditárias em função do gene, que ocorrem de forma independente para a seqüência de DNA. A base molecular da regulação do gene epigenético é complexa, mas essencialmente envolve modificações no próprio DNA ou as proteínas com as quais DNA associados. A modificação epigenética predominante de DNA em genomas de mamíferos é a metilação dos nucleotídeos citosina (5-MEC). Metilação do DNA fornece instruções para máquinas de expressão gênica de onde e quando o gene deve ser expresso. A seqüência alvo principal para a metilação do DNA em mamíferos é 5'-CpG-3 'dinucleotídeos (Figura 1). Dinucleotídeos CpG não são uniformemente distribuídos por todo o genoma, mas estão concentrados em regiões de seqüências genômicas repetitivos e CpG "ilhas" comumente associado com os promotores de gene (Figura 1). Padrões de metilação do DNA são estabelecidos no início do desenvolvimento, modulados durante a diferenciação de tecidos específicos e interrompida em muitos estados de doenças incluindo o câncer. Para understand o papel biológico de metilação do DNA e seu papel na doença humana, precisa, eficiente e reprodutível métodos são necessários para detectar e quantificar cada 5-MEC.

Este protocolo para a conversão de bissulfito é o "padrão ouro" para a análise de metilação do DNA e facilita a identificação e quantificação de metilação do DNA em resolução de nucleotídeo único. A química da desaminação de citosina por bissulfito de sódio envolve três etapas (Figura 2). (1) sulfonação: A adição de bissulfito à ligação 5-6 dobro de citosina Desaminação (2) hydrolic: desaminação hidrolítica do derivado resultante citosina-bissulfito de dar um derivado uracil bissulfito (3) Desulphonation Alkali: A remoção do sulfonato grupo por um tratamento alcalino, para dar uracil. Bissulfito preferencialmente deaminatos de citosina a uracil em DNA de fita simples, enquanto o 5-MEC, é refratária ao bissulfito mediada desaminação. Após a amplificação pela PCR, uracila é amplificadacomo timina enquanto 5-MEC resíduos permanecem como citosinas, permitindo CpGs metilado para ser distinguido de CpGs unmethylated pela presença de um "C" versus citosina timina "T" de resíduos durante o seqüenciamento.

DNA de modificação pela conversão de bissulfito é um protocolo bem estabelecido que pode ser explorado para muitos métodos de análise de metilação do DNA. Desde a detecção de 5-MEC pela conversão de bissulfito foi primeiramente demonstrada por Frommer et al. ¹ e Clark et al. ^2, os métodos baseados em torno de conversão de bissulfito de conta de DNA genômico para a maioria dos novos dados sobre a metilação do DNA. Diferentes métodos de análise pós PCR podem ser utilizados, dependendo do grau de especificidade e resolução de metilação necessário. Clonagem e sequenciamento é ainda o método mais prontamente disponíveis que podem dar resolução de nucleotídeo único para metilação do outro lado da molécula de DNA.

Protocol

Bissulfito de conversão de protocolo

Um protocolo padrão para a conversão de 2 microgramas de DNA genômico é descrito abaixo. Quantidades maiores ou menores do DNA genômico (100 pg-200 mg) também pode ser tratada com sucesso bissulfito. Estas condições de reação resultar em conversão completa (99,5-99,7%) de quase todas as seqüências de DNA alvo ^3.

1. Preparação DNA

Preparação de amostras, incubando DNA genômico com tampão de bissulfito de DNA de Lise (2 mg t RNA, 280 ng / mL de Proteinase K, SDS 1%) em um volume total de 18 mL para 1 hr a 37 ° C. Nota: Isto é importante para alcançar conversão de bissulfito máxima, especialmente com DNA isolado de amostras clínicas, onde ainda pode haver proteína associada com o DNA.

2. DNA Desnaturação

1. Desnaturar DNA mg 2 em um volume de 20 l, adicionando 2 l da recém-preparados 3M NaOH para um final de cONCENTRAÇÃO de 0.3M.
2. Incubar as amostras a 37 ° C por 15 min em banho-maria, seguido de incubação a 90 ° C por 2 min em um bloco de calor. Colocar imediatamente os tubos em gelo durante 5 min.
3. Centrifugar os tubos a 4 ° C por 10 s em 10.000 g, para garantir o DNA está no fundo do tubo.

3. Desaminação bissulfito

Sulfonação e desaminação hidrolítica

1. Preparar soluções fresco de 10 mM quinol e saturado de sódio metabissulfito de pH 5,0 (7,6 g Na ₂ S ₂ O ₅ com 464 mL de NaOH 10 M, feita até 15 ml com água). A solução de bissulfito de sódio saturada é obtida invertendo suavemente o reagente / H mistura O _2, com mínimo de mistura e aeração. Se necessário, ajustar o pH com NaOH 10 M, para a dissolução total da Nota de metabissulfito de:. Como é uma solução saturada, pequenos caroços ainda pode permanecer não dissolvida.
2. Adicionar 208mL do metabissulfito de saturada e 12 mL de quinol 10mM para o DNA desnaturado (20 l), em um volume final de 240 mL para uma concentração final de 2.31M bisulphite/0.5mM quinol, pH 5.0. Misture suavemente todos os reagentes e centrifugar por 10 segundos para garantir a todos as gotas são na parte inferior do tubo.
3. Sobreposição das amostras, com 200 mL de óleo mineral. Incubar as amostras a 55 ° C em banho-maria, por 4-16 horas. A duração do tratamento bissulfito é dependente da quantidade e qualidade do DNA a ser convertido. Para o DNA de má qualidade ou DNA degradado, limitar o tempo de incubação a 4 horas. Nota: é importante que que a conversão de bissulfito ocorre no escuro para evitar a oxidação, por isso, se isso não é possível envolver os tubos em alumínio antes da incubação .
4. No final do tempo de incubação apropriado, spin os tubos brevemente em uma microcentrífuga para garantir todo o líquido está no fundo do tubo.
5. Recuperar o DNA de bissulfito de tratadosdebaixo da camada de óleo com cuidado pipetagem fora da solução de DNA a partir do fundo do tubo, sem ocupar qualquer um dos óleos minerais.

Dessalinização

5. Remova todos os íons livres de bissulfito passando por uma coluna de dessalinização e eluição em 50 ul de água milli-Q (MQH ₂ O). Dependendo da quantidade e qualidade do DNA genômico e como ele é preparado, diferentes colunas dessalinização pode ser usado. Nós usam rotineiramente Promega Assistente Clean up colunas, como estas colunas são adequados para remover o SDS utilizados na preparação do DNA antes da conversão.

Desulphonation alcalinos

6. O aduto de bissulfito é removido do anel de uracil por desulphonation. Desulphonate adicionando 5,5 mL de NaOH 3M preparada para uma concentração final de 0.3M, em seguida, incubar as amostras a 37 ° C por 15 min.
7. Centrifugar brevemente e adicione 1 ml de RNA t (10 mg / ml).
8. Neutralize a solução com a adição de 33 mL de acetato de amónio (NH ₄ O Ac), pH 7,0 para uma concentração final da 3M.
9. Etanol precipitar-DNA, adicionando a 330 mL de etanol 100% gelado, misture bem por inversão. Deixe-a 20μC para 1 hr durante a noite. Centrifugar a 14.000 g por 15 min a 4 ° C. Remover todos os vestígios do sobrenadante e ar seco o DNA precipitado para ~ 20 min.
10. Re-suspender o pellet de DNA em 50 ul / g de 0,1 TE (10 mM Tris-HCL, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) ou H ₂ O. Deixe em temperatura ambiente por cerca de 2 horas. Ocasionalmente vortex os tubos para assegurar o DNA é dissolvido, seguido por uma centrifugação rápida.
11. Use imediatamente para a amplificação, ou armazenar a -20 ° C para 10-10 anos, dependendo da quantidade e qualidade do DNA.

4. Amplificação PCR

Design de Primer

1. Projeto eficaz de PCR bissulfito de conversão de primers específicos é crucial para assegurar que a amplificação, eficiente imparciais sobre DNA completamente convertido ocorre. As diretrizes a seguir são usados ​​para ajudar desenho de primers.

Diretrizes de design Primer

Thermocyling

2. Para testar a amplificação pela PCR proporcional de DNA metilado e não metilado, use um 50:50 metilados / unmethylated amostra de controlo totalmente convertido bissulfito e amplificar com o bissulfito de conversão de primers específicos sob o otimizado condições de reação de PCR (Figura 3). Para o metilados 50:50: controle não metilado, use in vitro DNA metilado SSSI e quer todo o genoma DNA amplificado (WGA) ou DNA de sangue total. Por favor, esteja ciente de que alguns genes metilados será naturalmente no sangue e, portanto, nesses casos o melhor é usar apenas WGA DNA como o controle "não metilado".
3. Prepare misturas de reacção PCR em 100 & mu; alíquotas l contendo 2 l de DNA genômico convertido bissulfito, 200 mM dNTP, 1 primers mM, 1,5 mM MgCl _2, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCL, pH 8,3 e 0,15 mL da polimerase Taq.
4. Em um termociclador gradiente de temperatura, defina a reação executado em um gradiente de + / - 3 ° C a partir do Tm previsto do primer em 10 tubos

5. Para testar se a metilado e não metilado amplicons foram amplificados em proporção, o amplicon pode ser digerido com uma enzima de restrição informativa, como Taq 1 (TCGA), que digerem o DNA metilado, mas não vai digerir DNA não metilado quando o site enzima de restrição é alteradas após a conversão de bissulfito de TTGA. A extensão da digestão pode ser visualizado por eletroforese em gel de agarose (Figura 3A). Alternativamente, SYBRGreen (0,2 mL de diluição de 1:1000) podem ser adicionados à reação de PCR eo grau de metilação podem ser avaliados através da realização de parcelas de calor em uma dissociação real-time PCR termociclador (Figura 3B).
6. PCR Reaction mix incluindo MgCl ₂ condições de concentração e termociclagem pode precisar de ser ajustado para aumentar a eficiência PCR ou para assegurar a ampliação proporcional da PCR metilado e não metilado fragmentos PCR.
7. Uma vez que as condições são otimizadas PCR, amplificação por PCR pode ser realizada em amostras de bissulfito de convertidos. Nota: Uma vez que o Tm é otimizado uma temperatura gradiente PCR não precisa ser usado.

5. Resultados representativos:

Um exemplo de otimização de bissulfito de amplificação por PCR é mostrado na Figura 3. Condições de amplificação ideal PCR deve amplificar metilado e não metilado amplicons, proporcionalmente e sem viés. Figura 3A mostra um gel de agarose com um perfil de temperatura de amplificação PCR gradiente de uma mistura de 50% DNA metilado e não metilado. Thamplicons e PCR têm sido tratados com uma enzima de restrição, Taq 1 (TCGA), que irá digerir metilado (M) DNA, mas não vai digerir unmethylated (U) DNA como o local enzima de restrição é alterada pela conversão de bissulfito de TTGA. Uma quantidade igual de corte e produto de PCR uncut é esperado se o DNA metilado e não metilado é amplificado na mesma proporção. Ele pode ser visto nesta gel que as condições ótimas para thermocyling não-preconceito de amplificação está em 56,1 ° C (T). Conversão completa do DNA de bissulfito também podem ser analisados ​​por digestão com enzima citosina-site específico, como Hpa III (CCGG). Hpa III só vai digerir se a conversão falhou, como o sítio de restrição será mantida. Se a conversão for concluída o sítio de restrição serão convertidos para TCGG ou TTGG dependendo do estado de metilação do DNA. Conversão de DNA completa de bissulfito pode ser visto na Figura 3A (H).

Figura 3B mostra um gráfico em tempo real que a dissociaçãotambém pode ser usado como uma ferramenta para determinar se existe qualquer viés de amplificação com base na temperatura em que as diferentes moléculas que se dissociam. Nesta figura pode-se ver que a PCR ampliou metilado (M) e não metilado de DNA (U), na proporção de uma mistura de 50% DNA metilado e não metilado em comparação com a amplificação de DNA de controle totalmente metilado e não metilado, que se dissociam em 82.1μC e 78.9μC respectivamente.

Após a otimização das condições de reação thermocyling e bissulfito de amostras tratadas pode ser amplificada com vertente específica e bissulfito de primers específicos em qualquer uma reação de PCR simples ou semi nested. Os fragmentos resultantes PCR pode ser visualizado por eletroforese em gel de agarose e seqüenciados diretamente (Figura 4A) ou por clonagem e seqüenciamento. Depois de clonagem e sequenciamento do estado de metilação das moléculas individuais podem ser tabulados, em um mapa de bissulfito (Figura 4B), para visualizar a heterogeneidade dosmetilação.

Alta taxa de análise de metilação quantitativa pode ser pré-formados usando a tecnologia como a utilizada pelo método EpiTYPER Sequenom. Usando este método, o DNA convertido bissulfito é amplificado com bissulfito PCR primers específicos e seguido por um processo de clivagem proprietry. Os fragmentos resultantes são quantificados por MALDI-TOF espectrometria de massa com o espectro específico depende da presença de citosinas metiladas (Figura 5A). Um resumo das razões de metilação na amostra pode ser extrapolado, na forma de um epigrama (Figura 5B) ou parcela de metilação (Figura 5C).

Figura 1. Esquemática CpG metilado. Na célula normal, promotor associado ilhas CpG não metiladas são predominantemente (cinza), enquanto sites de CpG no gene corpos são escassos e geralmente metilado (vermelho). O painel da direita se expande a estrutura molecularure de DNA em um site individual CpG e mostra metilação com uma molécula de carbono CH3 em 5 de citosina.

Figura 2. . Chemical esquema de conversão Análise de metilação do DNA inclui quatro fases principais, como mostrado; desnaturação, a conversão de bissulfito, amplificação e análise. No painel direito, modificações na molécula de citosina que ocorrem durante a conversão de bissulfito são retratados.

Figura 3. Otimização de PCR de amplificação. A. Eletroforese em gel de agarose com um perfil de temperatura de amplificação PCR gradiente de uma mistura de 50% DNA metilado e não metilado. Fragmentos foram digeridos com o Taq1 (T) ou HpaIII (H), que digerem o DNA metilado e DNA bissulfito não convertido, respectivamente. B. Calor análise da curva de dissociação mostra uma equal proporção de DNA metilado e não metilado (linha vermelha mix 50/50) em comparação com o controle de amplificação totalmente metilados (linha rosa, M) e DNA não metilado (linha verde, U), que se dissociam de 82,1 ° C e 78,9 ° C, respectivamente.

Figura 4. Exemplo de seqüenciamento direto e um mapa de bissulfito. A. Trace seqüência de três linhas de células diferentes com sítios CpG realçado em amarelo. Célula da linha X exibe metilação 100% em todos os três locais CpG enquanto célula linhas Y e Z mostram diferentes graus de metilação, como visto pela sobreposição G / A sinais. B. Representante bissulfito mapa que mostra a densidade de metilação (pontos vermelhos) em sites individuais CpG, conforme determinado pelo seqüenciamento direto de clones individuais.

Figura 5. Alta taxa de análise de metilação do DNA usando Sequenom. A. Vista espectro usando a tecnologia Sequenom epiTYPER. Fragmentos de DNA mostrar espectros específicos, dependendo da quantidade de presentes a metilação do DNA. B. Epigram resumo da porcentagem de metilação do DNA em cada local de CpG por quatro diferentes linhagens celulares. C. resumo do enredo de metilação derivado da Epigram Sequenom.

Discussion

Análise de DNA por metilação do DNA sequenciamento genômico convertido bissulfito é um método bem estabelecido e versátil, que facilita a identificação e quantificação de metilação do DNA em resolução de nucleotídeo único. No entanto, a conversão de bissulfito e posterior análise baseia-se na premissa de que o DNA foi totalmente convertido com cada citosina unmethylated sendo desaminada de uracil e só citosinas metiladas restantes un-reativa. Se a conversão é incompleta, podem surgir problemas com a análise já que não convertida citosinas não metiladas podem ser incorretamente interpretado como citosinas metiladas. Conversão de bissulfito pode ser otimizado em vários estágios para maximizar a percentagem de conversão. Para o DNA para ser totalmente convertida em primeiro lugar deve ser fita simples de modo que os resíduos de citosina estão expostos aos íons bissulfito. O primeiro passo, desnaturação do DNA, é crítico e pode ser a fonte de conversão incompleta se o DNA não é totalmente desnaturado. Para garantirque o DNA é totalmente desnaturado, é importante que os parâmetros de reação, incluindo a remoção de todas as proteínas associadas, concentração de sal adequada, a temperatura de incubação e tempo são adequados para manter o DNA na conformação de fita simples. É importante usar fresco 3M NaOH e para dar tempo de incubação adequada. Se o DNA está resistindo desnaturação, algumas modificações no protocolo incluindo o alargamento do tempo de incubação a 30 minutos ou a fragmentação do DNA antes da desnaturação pode facilitar a desnaturação do DNA. Além disso, DNA de fita simples (ssDNA) pode re-anneal dobrar DNA de fita (dsDNA) durante a reação de conversão de bissulfito. Realizar a reação a uma temperatura superior (90-95 ° C) ou periodicamente, ou de forma contínua durante a reação de bissulfito pode ajudar a manutenção de ssDNA. No entanto, é importante estar ciente de que a degradação do DNA é muito acelerado a estas temperaturas mais elevadas. Vários reagentes também pode ser adicionado para interromper re-annealing of thfitas de DNA e, como a uréia.

A concentração de DNA e sua qualidade também pode afetar a eficiência da reação de bissulfito PCR e rendimento final. Degradação do DNA é uma limitação do protocolo de conversão de bissulfito. O tratamento químico do DNA introduz rupturas dos filamentos vários ssDNA e algumas das duras condições necessárias para a conversão de bissulfito completo, incluindo concentração de bissulfito de alta, os tempos de incubação longo podem acelerar a degradação do DNA. Nas condições de reação padrão descrito, a degradação do DNA não é um problema comum no entanto, se as modificações de protocolo são introduzidos, como por sequências que são refratários à conversão, para modelos de DNA que estão degradadas ou de baixa qualidade, tais como amostras de FFPE, em seguida, degradação do DNA pode se tornar uma limitação significativa.

Formalina parafina, fixo incorporado (FFPE) e amostras de DNA degradado pode ser efetivamente bissulfito convertido e amplificado utilizando este protocolo, No entanto modificações para garantir que o DNA não é mais degradadas são aconselhados. O uso de uma RNA transportador, tais como t RNA é recomendado. Glicogênio também pode ser adicionado como um transportador quando a concentração de DNA é baixa (<200 ng). Como o DNA isolado de tecidos FFPE já está fragmentado e fragmentação ocorre durante desaminação, os cuidados devem ser tomados para minimizar a degradação ainda mais. Não fragmento de DNA mais longe antes de desnaturação e limitar o tempo de incubação para a reação bissulfito a 4 horas. Design amplicons não maior do que 300 bp DNA devido a fragmentada.

Outro fator que pode afetar a amplificação por PCR que a conversão de bissulfito de citosinas não metiladas reduz a complexidade do modelo de DNA. O protocolo do projeto a seguir cartilha descritos na seção 4.1, o comprimento aumentou primário e PCR aninhado podem ajudar a aumentar a especificidade e rendimento de PCR.

Finalmente, uma vez que o modelo de DNA é alterada durante bisulphite de conversão, o viés de amplificação pode ser uma preocupação. Garantir que a amplificação PCR proporcional de modelos metilado e não metilado é verificada com um controle de mix 50/50 DNA M / U, conforme descrito no protocolo, veja a Figura 3. Também garantir que a amplificação de modelos apenas convertido está ocorrendo usando HpaIII enzima de restrição e eletroforese em gel (Figura 3). As condições de PCR podem precisar de ser otimizado através da variação da temperatura e concentração de / ou magnésio ou alongamento do tempo de extensão. Alguns modelos parecem ser particularmente problemática ea posição cartilha pode ter de ser ajustada ou iniciadores degenerados podem precisar de ser usado.

Técnicas de sequenciamento de última geração estão evoluindo rapidamente para conseguir uma resolução semelhante à de bissulfito de sequenciamento genômico, ea terceira geração de seqüenciamento única molécula tem potencial para permitir a análise de DNA de ambos primários e metilação sem a necessidade de seqüenciamento de bissulfito. No entanto, disponibilidade generalizada e especificaçõesificity destas técnicas permanecem algum tempo afastado. Sequenciamento genômico bissulfito é o padrão-ouro na análise de metilação e é um protocolo robusto. O método tem progredido ao ponto onde os problemas comuns e limitações foram resolvidas e as aplicações têm se expandido a partir de análises de genes individuais de alto rendimento e análise de genoma descrito por Clark et al. 2006 ^4. Diretrizes solução de problemas e recomendações adicionais estão descritos na Tabela 1. Sugere-se que a abordagem ideal é inicialmente seguir o protocolo padrão e apenas introduzir modificações se e quando surge um problema.

Tabela 1. Diretrizes Troubleshooting

Materials