Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.
1. Injeção de fatores de reprogramação na
- configuração do cérebro animal, colocação estereotáxica e perfuraçãoNOTA: Este protocolo se concentra no uso de Ascl1, Lmx1a e Nurr1 (ALN) para a reprogramação da glia NG2 (Neurônio-Antígeno Glial 2) em interneurônios. Em nossa experiência, interneurônios de um fenótipo semelhante podem ser obtidos usando outras combinações de fatores
- Mova o braço M/L-D/V da estrutura estereotáxica para o lugar (acima do animal) e prenda-o.
NOTA: A estrutura estereotáxica permite o ajuste da seringa ao longo do eixo Anterior/Posterior (A/P, eixo Y), Medial/Lateral (eixo M/L, X), e eixo Dorsal/Ventral (D/V, eixo Z). - Mova a seringa ao longo dos diferentes eixos da estrutura estereotáxica para trazer a ponta do capilar de vidro logo acima do bregma (o ponto de junção onde as diferentes placas cranianas se encontram).
- Certifique-se de que a ponta capilar esteja perfeitamente reta nos planos A/P e M/L. No caso de um bregma ambíguo, faça a média das suturas lateral e da linha média.
- Quando a ponta do capilar estiver corretamente colocada acima do bregma, redefina os valores M/L e A/P para 0.0 no contador de coordenadas digital.
- Para garantir que a cabeça do animal esteja em uma posição perfeitamente plana, use o contador de coordenadas digital para medir o valor da coordenada D/V quando o braço A/P estiver em +2,0 e -2,0 (M/L = 0,0), bem como quando o braço M/L estiver em +2,0 e -2,0 (A/P = 0,0). Ajuste a altura da barra de dente e das barras auriculares de acordo.
- Mova a seringa para as coordenadas desejadas para injeção de vetores virais no estriado (A/P = +1,0; M/L = -2,0, em relação ao bregma).
- Levante ligeiramente a seringa e, olhando para o local da injeção através do microscópio, faça um furo com uma broca dentária nas coordenadas da injeção. Comece a perfurar no local, trabalhando de forma circular e suave.
NOTA: Não coloque muita pressão para baixo, pois a broca deve ser afiada o suficiente para atravessar o osso sem força adicional. Evite perfurações longas e sustentadas, pois isso cria calor. - No final da perfuração, verifique se a dura-máter permanece intacta e exposta para injeção.
- Preparação da configuração da seringa
- Coloque um pedaço de gaze de algodão sobre a incisão aberta e lave a seringa com solução salina.
- Após a lavagem, pegue uma bolha de ar de 1–2 μL, seguida por 1 μL de solução contendo os vetores virais, evitando bolhas não intencionais. Certifique-se de que a solução viral possa ser facilmente visualizada abaixo da bolha de ar, enquanto está sendo injetada.
- Viral injection
- Remova a gaze de algodão sobre o local da incisão e abaixe a seringa usando o braço D/V da estrutura estereotáxica. À medida que a superfície do crânio é abordada, olhe cuidadosamente através do microscópio e meça o nível D / V da dura-máter - ele deve inchar ligeiramente sob pressão suave.
- Ao tocar a dura-máter com a ponta do capilar, ajuste a coordenada D/V para 0,0.
- Abaixe a seringa, progredindo lentamente até a profundidade desejada (D/V = -2,7, em relação à dura-máter). Certifique-se de que a trajetória esteja livre de fragmentos ósseos, para que nenhuma curvatura da agulha/capilar seja observada.
NOTA: As coordenadas apresentadas referem-se a uma injeção dos fatores de reprogramação no estriado de camundongos NG2-Cre. Coordenadas correspondentes a outras regiões do cérebro podem ser usadas. Sempre teste as coordenadas para injeção primeiro usando um corante (por exemplo, Trypan Blue), injeção de contas coloridas ou um vetor viral repórter antes da injeção de fatores de reprogramação no cérebro de uma nova cepa de camundongo. Se injetar Trypan Blue, os animais precisam ser sacrificados imediatamente após a cirurgia e o cérebro dissecado. Cérebros frescos podem ser cortados usando um micrótomo, enquanto congelados, e o local da injeção determinado pela visualização da posição do corante no cérebro. Se testar coordenadas usando contas coloridas, é possível determinar o local da injeção em cérebros perfundidos e cortados uma semana após a injeção. Alternativamente, uma injeção com um vetor viral carregando um gene repórter pode ser usada e o local da injeção determinado em cérebros cortados perfundidos. - Injete 1 μL da solução viral a uma taxa de 0,4 μL / min. Quando todo o volume for injetado, aguarde um período de difusão de 2 min antes da retirada da seringa.
- Após a difusão, retraia lentamente a seringa até que a ponta do capilar esteja completamente fora do cérebro.
- Coloque um pedaço de gaze de algodão sobre a ferida e lave a seringa com solução salina.
- Mova o braço M/L-D/V da estrutura estereotáxica para fora da área de trabalho.
- Fechamento de feridas e procedimentos pós-operatórios
- Suture cuidadosamente a incisão usando fio de sutura.
NOTA: Todos os fios de sutura usados em animais injetados devem ser descartados em um copo/frasco contendo uma solução detergente antiviral. A mesma solução é usada para limpar todas as superfícies ao redor da área cirúrgica que estiveram em contato com materiais cirúrgicos. Todas as ferramentas cirúrgicas são cuidadosamente lavadas e autoclavadas no final de cada dia de cirurgia. - Remova o animal da estrutura estereotáxica e coloque-o em uma estação pós-operatória, que inclui uma gaiola limpa e aquecida, acesso a comida e água e onde o animal permanece até ficar totalmente acordado. Durante este período, monitore o animal de perto até que a consciência seja recuperada.
- Não alojar animais operados com animais não operados até que os primeiros tenham recuperado totalmente da cirurgia.
- Supervisionar os animais operados diariamente. Dependendo das suturas utilizadas, certifique-se de que sejam removidas, se necessário. Todos os animais receberam Bupenorphinum (Temgesic a 1ml/kg) por via subcutânea como cuidados pós-operatórios.
NOTA: Se operar com a mesma seringa em dois dias consecutivos, lave-a com água, seguida de etanol 70% e água novamente. Deixe a seringa cheia de água durante a noite para permitir a dissolução de quaisquer possíveis resíduos.