Entrega eletroforética de GABA no foco epiléptico de um camundongo anestesiado

Resumo

Fonte: Slezia, A. et al. A entrega eletroforética de ácido γ-aminobutírico (GABA) no foco epiléptico previne convulsões em camundongos. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a entrega eletroforética de ácido gama-aminobutírico (GABA) para inibir a atividade convulsiva em um camundongo anestesiado. Ele descreve as etapas envolvidas na implantação da sonda, registro da atividade neural, indução de convulsões e entrega controlada de GABA por meio de uma bomba de íons microfluídica para avaliar sua eficácia terapêutica.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Cirurgia / Craniotomia

1. Fixe a cabeça de um camundongo anestesiado em uma estrutura estereotáxica. Usando uma agulha de 30 G, injete analgésico local ropivacaína (5 μL, 7,5 mg / mL, consulte a Tabela de Materiais) por via subcutânea no local da incisão planejada. Aguarde 5 minutos para que faça efeito.
2. Faça uma linha média de corte reto na pele acima do crânio com um bisturi. Puxe suavemente a pele para os lados com uma pinça fina e prenda-a de lado com grampos de serrefine de buldogue para deixar o crânio exposto para trabalhos posteriores.
3. Limpe o crânio da fáscia com um bisturi ou qualquer ferramenta semelhante. Em caso de sangramento superficial, remova o sangue com cotonetes ou pequenos pedaços de papel toalha.
4. Pegue um parafuso de aterramento revestido com poli(3,4-etilenodioxitiofeno) poliestireno sulfonato (PEDOT:PSS) (tamanho: #00, diâmetro: 0.047 pol., comprimento: 1/8 pol., consulte a Tabela de Materiais) com um fio soldado e conecte-o com um conector ao cabeçote do amplificadorstage.
5. Umedeça o crânio no local do orifício desejado e faça um orifício em alta velocidade usando uma broca fina e redonda (com 0,4 mm de diâmetro) no crânio acima do cerebelo até que a dura-máter fique visível. Coloque o parafuso de aterramento no orifício e aparafuse-o com uma chave de fenda de precisão até atingir o topo do cerebelo.
   NOTA: O parafuso de cabeça foi revestido por imersão com uma solução PEDOT:PSS contendo 1% de 3-glicidiloxipropil)trimetoxissilano (GOPS) em peso, seguido de cozimento a 140 °C por 90 min. PEDOT:PSS é um polímero conjugado com uma capacitância volumétrica conhecida por ser biocompatível. GOPS é um reticulador misturado com PEDOT:PSS para aumentar a estabilidade em meio aquoso (Figura 1).
6. Com a ajuda do quadro estereotáxico, meça as coordenadas estereotáxicas para a região cerebral desejada. Por exemplo, a região de interesse é o hipocampo, ântero-posterior (AP) -1,8 mm e mediolateral (ML) a 1,8 mm do ponto de Bregma com base no atlas cerebral de camundongos.
   NOTA: Estas são coordenadas para o hemisfério direito (Figura 1).
7. Dilua uma área de aproximadamente 1 a 2 mm de diâmetro do crânio acima da região alvo usando uma broca odontológica confiável (ver Tabela de materiais) ajustada em alta velocidade até que uma membrana óssea fina, bem polida e transparente permaneça.
8. Então, se a espessura da membrana óssea for fina o suficiente (<200 μm), faça um pequeno orifício com uma pinça fina e remova suavemente a fina camada do osso. Use uma agulha com ponta de gancho feita sob medida para remover a dura-máter. Minimizar o tamanho da craniotomia e durotomia para prevenir o desenvolvimento de edemas e minimizar as pulsações cardíacas e/ou respiratórias do cérebro.
   NOTA: A craniotomia deve ser preenchida com uma gota de solução salina para evitar o ressecamento e, em seguida, reabastecida regularmente durante o experimento (Figura 1).

2. Inserção da Sonda de Silício Multicanal

1. Use braços estereotáxicos em um leve ângulo AP (20°) para a sonda de silício para deixar amplo espaço para o posicionamento dos outros dois implantes e ter os locais de gravação e injeção do eletrodo, bomba de íons e micropipeta o mais próximo possível.
   OBSERVAÇÃO: Eletrodos, seringas e bombas de íons foram cobertos com uma gota de solução de coloração DiI (perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina [DiI]), para a visualização post hoc dos traços de implantação (0,5 mg/ml DiI em dimetilsulfóxido).
2. Coloque a sonda de silicone no braço estereotáxico preso a um suporte magnético e coloque-a ao lado da estrutura estereotáxica. Defina o ângulo AP (20°) e, em seguida, conecte a sonda ao headstage e ao parafuso de aterramento.
3. Abaixe lentamente a sonda de silício no hipocampo com a ajuda do braço estereotáxico de precisão de mícrons ou de um micromanipulador motorizado para evitar movimentos laterais (Figura 1 e Figura 2).
   1. Inicie o software de gravação e registre - com o headstage, o amplificador conectado e um computador - sinais neuronais elétricos enquanto move a sonda de silício multicanal do topo do córtex até que a posição dorsoventral (DV) alvo seja alcançada (-1.800 μm da superfície cortical). Grave e observe o sinal de potencial de campo local (LFP) durante a penetração na tela do computador.
      NOTA: Controle a descida da sonda para que ela se mova lenta e continuamente durante a gravação, para ter melhor controle visual para a penetração e para atingir a zona alvo.
   2. Use a atividade de ondulação na camada piramidal da formação hipocampal no LFP registrado como um marcador da zona-alvo.
      NOTA: A atividade de ondulação é visível em um ou dois canais vizinhos da sonda multicanal de silício (Si) com uma distância de 100 μm entre os locais de gravação (Figura 3).
   3. Registre os sinais LFP das camadas do córtex e do hipocampo simultaneamente através do software do amplificador multicanal (ver Tabela de Materiais) com a ajuda das sondas de Si multicanal (Figura 3).

3. Inserção da bomba de íons microfluídicos (μFIP)

1. Conecte os tubos (consulte a Tabela de Materiais) à entrada do μFIP e encha a sonda com solução de ácido gama-aminobutírico (GABA) 0,05 M. Remova os tubos e feche a entrada com filme de parafina. Conecte os cabos elétricos à unidade de medição da fonte.
2. Insira o μFIP com a ajuda do braço estereotáxico em um ângulo mediolateral (MP) (20°). A sonda de Si permanece inserida durante todo o processo.
   NOTA: O μFIP é muito flexível e pode se beneficiar do apoio de um pincel pequeno e limpo para mantê-lo reto até atingir a superfície cerebral. Após essa etapa, o μFIP pode ser abaixado suavemente com movimentos axiais.
3. Abaixe o μFIP lentamente com movimentos axiais e nunca o deixe dobrar durante a trajetória até atingir a coordenada dorsoventral (DV) (-1.200 μm da superfície cortical).
   NOTA: Tente colocar os dois dispositivos (μFIP e sonda de silício) o mais próximo possível um do outro, considerando a distância de 300 μm da saída da ponta do μFIP.
   CUIDADO: Evite problemas mecânicos entre os dispositivos e seus conectores durante a inserção (Figura 1B e Figura 2B).

4. Preparação de dispositivos para indução de convulsões

1. Troque a agulha de metal da seringa (10 μL) (consulte a Tabela de Materiais). Remova a parte metálica que segura a agulha, coloque e fixe a micropipeta (diâmetro externo [OD]: 1.2 mm, diâmetro interno [ID]: 0.75 mm, diâmetro da ponta: 20–50 μm com ± 0.5 cm de afunilamento da haste) e, em seguida, substitua o elemento de fixação da agulha.
2. Posicione a seringa e a micropipeta de borossilicato anexada em um ângulo lateromedial (LM) de 20° para a injeção de 4-aminopiridina (4AP) (50 mM no líquido cefalorraquidiano artificial [ACSF]).
   CUIDADO: Não use a agulha de metal da seringa ou uma micropipeta com uma ponta maior que 50 μm.
3. Extraia 500 nL–1 μL de 50 mM 4AP com a ajuda de uma bomba de microinjeção automatizada.

5. Inserção da pipeta de vidro conectada a uma seringa para injeção de 4AP

1. Abaixe a micropipeta de vidro conectada à seringa para a posição DV desejada (-1.500 μm) e, em seguida, injete 250 nL da solução de 4AP (Figura 1 e Figura 2). Comece a gravar com o software de gravação. Observe a tela e aguarde o primeiro pico interictal aparecer.
2. Inicie a entrega de GABA por μFIP imediatamente com o aparecimento do primeiro pico interictal. Forneça GABA aplicando 1 V entre a fonte e o alvo por 100 s, seguido de 1 s desligado por 30 ciclos. Com a ajuda do software de gravação, grave por no mínimo 2 h.
   NOTA: A massa total do GABA fornecido é de cerca de 1 nmol (Figura 4).
3. No final do experimento, remova cuidadosamente as sondas inseridas e o parafuso de aterramento e remova o animal do equipamento estereotáxico. Os animais foram eutanasiados com overdose de droga (i.p.100mg/kg de pentobarbital). A morte foi confirmada pela cessação da respiração e da circulação.

Resultados

Figura 1: Cranio-durotomia e localização dos implantes no cérebro do camundongo. (A) Visão esquemática da cirurgia, da craniotomia e do alvo dos implantes no cérebro do camundongo. (B) Coordenadas e ângulos es...

Materiais