Injeção viral estereotáxica para edição de genes neuronais direcionados no cérebro de camundongos

Resumo

Fonte: Fricano-Kugler, C. J., et al. Projeto, embalagem e entrega de CRISPR retro e lentivírus de alto título por meio de injeção estereotáxica. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a injeção viral estereotáxica para edição precisa de genes neuronais no cérebro de camundongos. O protocolo garante a entrega precisa do vírus ao giro denteado, permitindo a marcação fluorescente e o nocaute genético mediado por CRISPR para estudar circuitos neurais, função gênica e mecanismos de doenças in vivo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Injeção estereotáxica

1. Confirme se a ventilação da sala de cirurgia está aberta para garantir o fluxo de ar adequado. Prepare o camundongo para a cirurgia anestesiando-o com isoflurano a 4% em uma câmara de indução. Após a anestesia, raspe a cabeça para preparar o local da injeção.
   1. Coloque o mouse no instrumento estereotáxico usando uma pinça para mover a língua para baixo e para o lado. Insira a barra de mordida na boca até que os dentes caiam na ranhura e, em seguida, prenda as barras auriculares. Certifique-se de que o corpo do mouse esteja na almofada de aquecimento e o nariz esteja situado no cone do nariz. Direcione o isoflurano a 4% para o cone do nariz. Confirme a anestesia beliscando o pé com uma pinça e garantindo que não haja reflexo de sobressalto.
   2. Aplique lágrimas artificiais para lubrificar os olhos. Termine de preparar o local da injeção esfregando a cabeça raspada com rodadas alternadas de iodopovidona e lidocaína.
2. Usando um bisturi, faça uma pequena incisão ao longo do centro do couro cabeludo. Seque o crânio com um cotonete e peróxido de hidrogênio, se necessário, para ajudar a visualizar o bregma.
   1. Usando um escopo de dissecação, localize o bregma no crânio e coloque a ponta da broca no bregma. Zero (ou registro) as coordenadas estereotáxicas digitais nos planos x, y e z.
   2. Para garantir que a cabeça esteja nivelada no eixo y rostral para caudal, coloque a broca em lambda e nivele a cabeça de modo que a coordenada z seja aproximadamente igual em bregma e lambda.
   3. Para garantir que a cabeça esteja nivelada no eixo x, coloque a broca em y = 1/2 lambda. Certifique-se de que a coordenada z seja igual a 1 mm de cada lado (x = +/- 1 mm) da sutura sagital. Ajuste o crânio se houver uma diferença na coordenada z a 1 mm à esquerda e à direita de lambda.
3. Coloque a broca sobre as coordenadas desejadas. Para o giro dentado, use as coordenadas y = -1,9 de bregma e x = +/- 1,1. Antes de perfurar, abaixe o isoflurano para 2% e, em seguida, perfure lenta e cuidadosamente o crânio.
   1. Depois de fazer todos os orifícios, fixe a seringa cheia no instrumento estereotáxico. Centralize visualmente a seringa sobre o orifício e zere a coordenada z no crânio.
   2. Abaixe lentamente a seringa até a profundidade z mais profunda. Para o giro denteado, as profundidades z são -2,5, -2,4 e -2,3. Inicie a injeção a uma taxa de 0,25 μl/min usando um injetor estereotáxico.
      1. Depois que a injeção estiver concluída na profundidade Z mais baixa, aguarde 1 min, aumente para a próxima coordenada e comece a injeção novamente. Continue esse padrão até que todas as coordenadas de injeção z sejam injetadas. Aguarde 2 minutos antes de remover a seringa após a última injeção.
         NOTA: Nenhum efeito adverso foi observado no tecido injetando até 2 μl de vírus por hemisfério no cérebro do camundongo.
   3. Repita a injeção para outros furos.
4. Após a injeção, remova o mouse do instrumento estereotáxico e suture o couro cabeludo com suturas de seda 6-0. Aplique lidocaína e um creme antibacteriano na ferida.
   1. Injete 0,8-1,0 ml de solução salina + cetoprofeno (3-5 mg/kg) por via intraperitoneal (I.P.) para controlar a dor. Em seguida, coloque o mouse na câmara de recuperação aquecida. Não deixe o animal sozinho até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Não devolva o animal à companhia de outros animais até que ele esteja totalmente recuperado.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Stereotaxic Surgery Reagents
Vet-Syringe vet use T.B. Seringa apenas 1cc luer slip T.B. 100/bx	Med-Vet International	1CCVLS Isoflurano
Lâminas de bisturi de aço inoxidável, #10, 100-pk	Med-Vet International	JOR580S
Pomada de lágrima artificial	Med-Vet International	RXPARALUBE-O
PVP PrepSolution	Med-Vet International	HPIV108208H
Aplicadores de soro normal	Med-Vet International	DYND500MLSH
Cotton	Med-Vet International	CTA6
Pomada antibiótica tripla	Med-Vet International	RXTRIP-OI15
MONOJECT® Agulhas Soft Pack 25g x 5/8"	Med-Vet International	25058
6-0 suturas de seda	Med-Vet International	MV-711