Visualização de redes neurais e vasculares em um embrião de galinha

Neste artigo

Resumo

Fonte: Delalande, J., et.al. Marcação dupla de células da crista neural e vasos sanguíneos em embriões de galinha usando enxerto de tubo neural^{Chick GFP} e injeção de corante de carbocianina DiI. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra o transplante de um tubo neural de doador marcado com GFP de um embrião de galinha transgênico compatível com o estágio para um embrião receptor no nível de somitos de um a sete, seguido de marcação vascular usando um corante fluorescente lipofílico. A abordagem combinada permite a visualização direta do embrião sob um microscópio de estereofluorescência, permitindo o estudo da integração do enxerto neural e do desenvolvimento da rede vascular in ovo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Enxertar o tecido

Usando uma micropipeta de vidro, transfira cuidadosamente o tubo neural dissecado do vidro do relógio para o embrião hospedeiro. Posicione o tubo neural na orientação ântero-posterior correta e empurre suavemente o explante adjacente à região excisada do hospedeiro do pintinho usando o microbisturi. Deixe um pequeno fragmento de ectoderma ligado ou cortando um pequeno corte na superfície dorsal para identificar a orientação do tubo neural.
1. Se necessário, use o microbisturi para aparar o explante no tamanho exato da região excisada.
Guie suavemente o tubo neural para a região ablacionada e posicione-o de forma que o lado dorsal fique orientado corretamente. Use uma micropipeta de vidro, montada em um tubo bucal, para remover o PBS e / ou fluido ao redor do enxerto. Isso ajuda os tecidos do doador e do hospedeiro a aderir e o enxerto a se estabelecer.
Sele toda a janela com fita transparente de 24 mm de largura para evitar desidratação e contaminação.
Rotule o embrião quimérico marcando com um lápis na casca do ovo e registre seu número no livro de laboratório. Devolva o ovo à incubadora para desenvolvimento posterior.

2. Injete DiI nos vasos sanguíneos do embrião hospedeiro

No momento experimental desejado (aqui, 3 a 10 dias depois), recupere o embrião quimérico da incubadora e remova a fita transparente usando uma tesoura reta para obter acesso ao embrião dentro do ovo.
Se necessário, amplie a janela na concha usando a tesoura. Tenha cuidado para não danificar a membrana corioalantóica se ela estiver presa à casca, o que resultaria em hemorragia e prejudicaria a marcação dos vasos sanguíneos.
Escolha uma veia acessível na gema, certificando-se de que o fluxo sanguíneo seja direcionado para o embrião. Escolha um ponto de ramificação de uma das veias vitelinas (Figura 1B, C).
NOTA: Em E6.5 - E7.5, a membrana corioalantóide pode precisar ser movida suavemente para o lado com uma pinça para acessar as veias vitelinos. Após E8.5, a única opção é injetar em uma das veias da membrana corioalantóide, pois, nesta fase, a membrana corioalantóide cobre totalmente o embrião.
Remova a membrana vitelina acima do ponto de injeção escolhido usando duas pinças Dumont #5 rasgando em direções opostas.
Quebre uma agulha de vidro puxada usando um Dumont #5 e ajuste seu diâmetro para o tamanho aproximado da veia antes de carregar com o CellTracker CM-DiI. Preparar a solução-mãe de DiI a 40 μg/μl em DMSO e conservar a -20 °C. Preparar a solução de trabalho em sacarose 0,3 M/PBS a uma concentração de 4 μg/μl.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Figura 1. Injeção intravenosa de DiI. (A) Instrumentos recomendados: a) CellTracker CM-DiI drop on parafilm, b) agulha de injeção de vidro puxada, c) tubo bucal. (B) Diagrama esquemático da injeção intravenosa de DiI em embrião...