Imagem in vitro em tempo real da ramificação axonal em neurônios corticais de camundongos

Resumo

Fonte: Winkle, C. C., et al. Utilizando metodologias combinadas para definir o papel da entrega da membrana plasmática durante a ramificação do axônio e a morfogênese neuronal. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra uma técnica de imagem ao vivo usando microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC) para observar a ramificação axonal em tempo real em neurônios corticais. Vídeos de lapso de tempo capturam os efeitos do tratamento com netrin-1, uma molécula de sinalização que induz exocitose localizada e rearranjos do citoesqueleto nos axônios. Esses processos iniciam saliências de membrana, que se desenvolvem em ramos axonais maduros, fornecendo informações sobre o desenvolvimento neuronal.

Protocolo

1. Microscopia de lapso de tempo de contraste de interferência diferencial (DIC) da ramificação do axônio

Nota: Embora este protocolo utilize DIC, outros métodos de microscopia de luz transmitida podem ser usados para os mesmos fins (por exemplo: contraste de fase).

1. Em 2 dias in vitro (DIV), coloque a placa de imagem com fundo de vidro contendo neurônios não transfectados em uma câmara ambiental pré-aquecida para manter um ambiente úmido com 5% de CO2 e 37 °C. Utilize um microscópio equipado com um plano-apocromático de 60X, lente objetiva DIC de abertura numérica (NA) de 1,4 e condensador de alta NA para melhor qualidade e resolução de imagem.
2. Ajuste o plano focal para encontrar neurônios através das oculares usando iluminação de luz transmitida.
3. Usando a função de aquisição de várias áreas no software de imagem, encontre e salve os locais XYZ de pelo menos 6 células. Posicione o palco de forma que os neurônios de interesse se encaixem no campo de visão para obter melhores resultados.
   1. Estimule com 250 ng/ml netrin-1 e pressione 'iniciar aquisição de área múltipla'. Adquira imagens sequencialmente em cada posição a cada 20 segundos por 24 horas, pausando a aquisição e refocando conforme necessário.
4. Revise imagens em software de imagem usando Apps>Review Multi Dimensional Data>open file name. Identifique ramos de axônios estáveis (20 μm de comprimento) que se formam durante a sessão de imagem. Use a ferramenta de desenho de linha para medir um ramo de axônio estável da base do axônio até a ponta para garantir que a qualificação de comprimento de 20 μm seja atendida.
   1. Em uma planilha, registre o número do quadro após a estimulação da netrina quando as saliências da membrana se iniciam em áreas onde os ramos se formam posteriormente, bem como o número do quadro após a estimulação da netrina quando os ramos nascentes atingem 20 μm de comprimento.
   2. Multiplique o número de quadros entre a saliência e a formação do ramo por 20 segundos para calcular o tempo de formação por ramo.

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