Imagem in vivo de dois fótons da dinâmica microglial no hipocampo de camundongos

Resumo

Fonte: Kamei, R., et. al., Imagem crônica de dois fótons in vivo da microglia no hipocampo de camundongos. J. Vis. Exp. (2022)

O vídeo demonstra o processo de configuração e imagem para microscopia in vivo de dois fótons da dinâmica microglial no hipocampo CA1 (Cornu ammonis 1) e giro denteado, garantindo o alinhamento óptico ideal e a avaliação da integridade estrutural.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. In vivo, imagem crônica de dois fótons da microglia usando camundongos CX3CR1-GFP

1. Após a indução da anestesia, lave o interior do tubo de metal com solução salina estéril para remover os detritos. Certifique-se de que o alvéus branco do hipocampo seja visível através do vidro (Figura 1A) e que não haja complicações, como sangramento pós-operatório.
2. Coloque o mouse sob o microscópio de dois fótons nas seguintes etapas:
   1. Coloque o mouse no dispositivo de fixação da cabeça sob a lente objetiva do microscópio de dois fótons e no estágio de varredura XY motorizado. Use uma almofada de aquecimento para suporte térmico. Monitore e ajuste a profundidade da anestesia, pois essa verificação de qualidade pode levar até 30 minutos. nota: Recomenda-se a lente objetiva de imersão em água com uma distância de trabalho (WD) superior a 3 mm e uma abertura numérica (NA) elevada. Um colar de correção da lente objetiva pode melhorar a resolução, compensando a incompatibilidade do índice de refração entre o vidro e os biomateriais.
   2. Preencha o espaço entre o vidro e a lente objetiva com água, tomando cuidado especial para evitar bolhas de ar. Se necessário, expanda a área da placa de metal usando um filme plástico, que retém mais água, para cobrir toda a lente frontal da objetiva.
   3. Ligue um laser pulsado de femtossegundo de comprimento de onda de 920 nm para a excitação das sondas fluorescentes expressas no cérebro e inicie o software de aquisição de imagem.
   4. Ajuste o foco para o CA1 (Cornu Ammonis 1) usando o estágio motorizado e o sistema de foco motorizado. Posicione a estrutura alvo com a orientação da fluorescência emitida pelo parênquima cerebral e a luz refletida da borda do tubo de metal sob iluminação contínua pelo laser pulsado.
   5. Meça as profundidades do parênquima cerebral tocando o fundo do vidro ajustando o foco com o sistema de foco motorizado. Compare as profundidades em diferentes locais horizontais para avaliar o alinhamento do fundo do vidro e o plano de imagem.
      1. Ajuste o ângulo da cabeça do mouse inclinando o dispositivo de fixação da cabeça até que o fundo do vidro fique paralelo ao plano de imagem.
   6. Ajuste o colar de correção da objetiva para obter a resolução mais alta na profundidade da estrutura alvo no CA1.
3. Verifique a qualidade e a intensidade das imagens obtidas por excitação de dois fótons do hipocampo (Figura 1B).
   NOTA: A deterioração da imagem indica a presença de dano tecidual no interior do cérebro.
4. Certifique-se de que a microglia já recuperou sua morfologia ramificada (Figura 1C).
   NOTA: Os dados de imagem da microglia indicam que são necessárias pelo menos 3-4 semanas para que a microglia retorne ao seu estado basal.
5. Realizar imagens in vivo em quaisquer camadas do CA1 para o propósito específico do experimento.

Resultados

Figura 1: Imagem in vivo da microglia em camundongos CX3CR1-GFP na fase crônica.) A aparência representativa da janela implantada no dorsal direito CA1 (Cornu Ammonis 1) na fase crônica...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Um laser pulsado de femtossegundo	Spectra-Physics	MaiTai Deep See	Um laser Ti:Sapphire usado no comprimento de onda de 920 nm.
Um microscópio de dois fótons	Nikon	A1R MP+	Microscópio para a imagem CA1.
Uma lente objetiva para imagens de dois fótons	Olympus	XLPLN25XSVMP	objetiva de 25× com uma longa distância de trabalho, uma alta abertura numérica e um colar de correção
Placas de alumínio	Narishige	CP-1	Placas feitas de alumínio para fixação da cabeça.
Lamínulas de vidro circulares	Matsunami Glass	3φ No.1	Lamínulas coladas a tubos de aço inoxidável.
Camundongos CX3CR1-GFP Camundongos	do Laboratório Jackson	8451	para imagens microgliais.
Tubos cilíndricos de aço inoxidável	MORISHITA	feitos sob medida	para serem implantados. Diâmetro externo 3,0 mm, diâmetro interno 2,8 mm, altura 1,7 mm.
Cimento de resina dental (Super-Bond C&B)	Sun Medical	204610555	Dental cement.
Dispositivo de fixação da cabeça	Narishige	MAG-2	O dispositivo de fixação da cabeça de ratos com ajustadores de ângulo
Almofada de aquecimento	Bio Research Center	BWT-100A e HB-10	Ferramentas para fornecer suporte térmico para o rato durante a cirurgia.
Almofada de aquecimento	ALA Scientific	HEATINGPAD-1 e Hot-1	Ferramentas para fornecer suporte térmico para o mouse no dispositivo de fixação da cabeça.
Cetamina (Ketalar)	Daiichi Sankyo Company	S9-001665	Anestesia durante a cirurgia.
Pomada oftálmica	Sato Pharmaceutical		Usado para prevenir o ressecamento dos olhos durante a cirurgia.
Solução de esfoliação de iodopovidona	Meiji Seika Pharma	2612701Q1137	Usado para desinfetar o local da cirurgia.
Microscópios estereoscópicos	Leica Microsystems	S8 APO	Microscópios para cirurgia.
Solução salina estéril	Otsuka Pharmaceutical Factory	3311401A2026	Solução de lavagem durante a cirurgia.
Almofada impermeável estéril	AS ONE	8-5945-01	Plataforma cirúrgica.
Xilazina (Celactal 2%)	Anestesia Bayer durante a		cirurgia.

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