Imagem in vivo de dois fótons da dinâmica microglial no hipocampo de camundongos

Resumo

Fonte: Kamei, R., et. al., Imagem crônica de dois fótons in vivo da microglia no hipocampo de camundongos. J. Vis. Exp. (2022)

O vídeo demonstra o processo de configuração e imagem para microscopia in vivo de dois fótons da dinâmica microglial no hipocampo CA1 (Cornu ammonis 1) e giro denteado, garantindo o alinhamento óptico ideal e a avaliação da integridade estrutural.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. In vivo, imagem crônica de dois fótons da microglia usando camundongos CX3CR1-GFP

1. Após a indução da anestesia, lave o interior do tubo de metal com solução salina estéril para remover os detritos. Certifique-se de que o alvéus branco do hipocampo seja visível através do vidro (Figura 1A) e que não haja complicações, como sangramento pós-operatório.
2. Coloque o mouse sob o microscópio de dois fótons nas seguintes etapas:
   1. Coloque o mouse no dispositivo de fixação da cabeça sob a lente objetiva do microscópio de dois fótons e no estágio de varredura XY motorizado. Use uma almofada de aquecimento para suporte térmico. Monitore e ajuste a profundidade da anestesia, pois essa verificação de qualidade pode levar até 30 minutos. nota: Recomenda-se a lente objetiva de imersão em água com uma distância de trabalho (WD) superior a 3 mm e uma abertura numérica (NA) elevada. Um colar de correção da lente objetiva pode melhorar a resolução, compensando a incompatibilidade do índice de refração entre o vidro e os biomateriais.
   2. Preencha o espaço entre o vidro e a lente objetiva com água, tomando cuidado especial para evitar bolhas de ar. Se necessário, expanda a área da placa de metal usando um filme plástico, que retém mais água, para cobrir toda a lente frontal da objetiva.
   3. Ligue um laser pulsado de femtossegundo de comprimento de onda de 920 nm para a excitação das sondas fluorescentes expressas no cérebro e inicie o software de aquisição de imagem.
   4. Ajuste o foco para o CA1 (Cornu Ammonis 1) usando o estágio motorizado e o sistema de foco motorizado. Posicione a estrutura alvo com a orientação da fluorescência emitida pelo parênquima cerebral e a luz refletida da borda do tubo de metal sob iluminação contínua pelo laser pulsado.
   5. Meça as profundidades do parênquima cerebral tocando o fundo do vidro ajustando o foco com o sistema de foco motorizado. Compare as profundidades em diferentes locais horizontais para avaliar o alinhamento do fundo do vidro e o plano de imagem.
      1. Ajuste o ângulo da cabeça do mouse inclinando o dispositivo de fixação da cabeça até que o fundo do vidro fique paralelo ao plano de imagem.
   6. Ajuste o colar de correção da objetiva para obter a resolução mais alta na profundidade da estrutura alvo no CA1.
3. Verifique a qualidade e a intensidade das imagens obtidas por excitação de dois fótons do hipocampo (Figura 1B).
   NOTA: A deterioração da imagem indica a presença de dano tecidual no interior do cérebro.
4. Certifique-se de que a microglia já recuperou sua morfologia ramificada (Figura 1C).
   NOTA: Os dados de imagem da microglia indicam que são necessárias pelo menos 3-4 semanas para que a microglia retorne ao seu estado basal.
5. Realizar imagens in vivo em quaisquer camadas do CA1 para o propósito específico do experimento.

Resultados

Figura 1: Imagem in vivo da microglia em camundongos CX3CR1-GFP na fase crônica.) A aparência representativa da janela implantada no dorsal direito CA1 (Cornu Ammonis 1) na fase crônica...

Materiais