Imagem in vivo de dois fótons da dinâmica microglial no hipocampo de camundongos

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. In vivo, imagem crônica de dois fótons da microglia usando camundongos CX3CR1-GFP

1. Após a indução da anestesia, lave o interior do tubo de metal com solução salina estéril para remover os detritos. Certifique-se de que o alvéus branco do hipocampo seja visível através do vidro (Figura 1A) e que não haja complicações, como sangramento pós-operatório.
2. Coloque o mouse sob o microscópio de dois fótons nas seguintes etapas:
   1. Coloque o mouse no dispositivo de fixação da cabeça sob a lente objetiva do microscópio de dois fótons e no estágio de varredura XY motorizado. Use uma almofada de aquecimento para suporte térmico. Monitore e ajuste a profundidade da anestesia, pois essa verificação de qualidade pode levar até 30 minutos. nota: Recomenda-se a lente objetiva de imersão em água com uma distância de trabalho (WD) superior a 3 mm e uma abertura numérica (NA) elevada. Um colar de correção da lente objetiva pode melhorar a resolução, compensando a incompatibilidade do índice de refração entre o vidro e os biomateriais.
   2. Preencha o espaço entre o vidro e a lente objetiva com água, tomando cuidado especial para evitar bolhas de ar. Se necessário, expanda a área da placa de metal usando um filme plástico, que retém mais água, para cobrir toda a lente frontal da objetiva.
   3. Ligue um laser pulsado de femtossegundo de comprimento de onda de 920 nm para a excitação das sondas fluorescentes expressas no cérebro e inicie o software de aquisição de imagem.
   4. Ajuste o foco para o CA1 (Cornu Ammonis 1) usando o estágio motorizado e o sistema de foco motorizado. Posicione a estrutura alvo com a orientação da fluorescência emitida pelo parênquima cerebral e a luz refletida da borda do tubo de metal sob iluminação contínua pelo laser pulsado.
   5. Meça as profundidades do parênquima cerebral tocando o fundo do vidro ajustando o foco com o sistema de foco motorizado. Compare as profundidades em diferentes locais horizontais para avaliar o alinhamento do fundo do vidro e o plano de imagem.
      1. Ajuste o ângulo da cabeça do mouse inclinando o dispositivo de fixação da cabeça até que o fundo do vidro fique paralelo ao plano de imagem.
   6. Ajuste o colar de correção da objetiva para obter a resolução mais alta na profundidade da estrutura alvo no CA1.
3. Verifique a qualidade e a intensidade das imagens obtidas por excitação de dois fótons do hipocampo (Figura 1B).
   NOTA: A deterioração da imagem indica a presença de dano tecidual no interior do cérebro.
4. Certifique-se de que a microglia já recuperou sua morfologia ramificada (Figura 1C).
   NOTA: Os dados de imagem da microglia indicam que são necessárias pelo menos 3-4 semanas para que a microglia retorne ao seu estado basal.
5. Realizar imagens in vivo em quaisquer camadas do CA1 para o propósito específico do experimento.

Figura 1: Imagem in vivo da microglia em camundongos CX3CR1-GFP na fase crônica.) A aparência representativa da janela implantada no dorsal direito CA1 (Cornu Ammonis 1) na fase crônica. Através do fundo de vidro, as fibras brancas do alvéus são claramente observadas sem sangramento pós-operatório. A CHD e o VE são parcialmente visíveis na área caudomedial e na borda rostrolateral, respectivamente. Barra de escala, 1 mm. (B) Reconstrução 3D representativa da imagem CA1 crônica in vivo de um camundongo CX3CR1-GFP no POD 24 (largura: 511 μm, altura: 511 μm, profundidade: 670 μm). (C) Imagens típicas de microglia de (B) com morfologia ramificada totalmente restaurada são mostradas como MIPs de pilhas de imagens GFP com 20 μm de espessura em profundidades de 100, 280 e 500 μm da superfície cirúrgica. Barras de escala, 50 μm.