Avaliação dos efeitos neuroprotetores do pós-condicionamento ácido em um modelo de camundongo com isquemia cerebral

Abstract

Fonte: Zheng, Y., et al. Modelos experimentais para estudar a neuroproteção do pós-condicionamento ácido contra isquemia cerebral. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a aplicação do pós-condicionamento ácido (APC) para avaliar seus efeitos neuroprotetores contra lesão isquêmica em um modelo de camundongo de oclusão da artéria cerebral média (MCAO). Ele descreve as etapas envolvidas na reperfusão no modelo MCAO e a aplicação de APC durante a reperfusão para mitigar a excitotoxicidade, o estresse oxidativo e a morte neuronal.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Oclusão da artéria cerebral média (MCAO):
   1. Coloque e fixe o camundongo anestesiado (com sonda de fluxometria doppler a laser (LDF) acoplada ao crânio) em decúbito dorsal e mantenha a temperatura corporal usando uma lâmpada de calor durante toda a cirurgia. Desinfete o pescoço com álcool etílico 70%.
   2. Faça uma incisão paramediana na pele do pescoço usando um bisturi; disseque os tecidos moles com uma pinça para expor os vasos. Adicione uma gota de solução salina aos tecidos expostos para mantê-los hidratados.
   3. Disseque a artéria carótida comum do tecido circundante e do nervo vago usando uma pinça oftálmica. Tenha cuidado para não danificar o nervo vago. Desinfete a pele do pescoço novamente com iodóforo após a exposição da artéria carótida comum.
   4. Coloque uma pinça de microvasos na extremidade distal da artéria carótida comum e, em seguida, dê um nó morto com suturas de seda 6-0 na extremidade proximal. Coloque o clamp o mais proximal possível para operações subsequentes. Certifique-se de que o comprimento do recipiente entre o clamp e o nó morto seja o maior possível para operações subsequentes.
   5. Faça uma sutura temporária proximal à pinça dando um nó solto. Certifique-se de que haja espaço suficiente entre dois nós para a inserção do monofilamento.
   6. Faça uma pequena incisão longitudinal entre os dois nós com uma tesoura micro-oftálmica. Certifique-se de que a incisão esteja o mais próximo possível do nó morto para operações subsequentes. Tenha cuidado para não cortar o recipiente.
   7. Insira um monofilamento embotado com a ponta de 12 mm através da incisão para entrar no lúmen da artéria e avance-o alguns mm. Aperte o nó solto ao redor da ponta do monofilamento e, em seguida, remova o clamp.
   8. Avance o filamento para a artéria carótida interna (10 mm para ocluir a artéria cerebral média) com uma pinça oftálmica até que o software LDF mostre um declínio acentuado (redução de >80% do fluxo sanguíneo basal) no fluxo sanguíneo. Registre a hora de início da oclusão.
   9. Ocluir a artéria cerebral média durante 1 h. Cortar a sonda LDF e colocar os ratinhos numa incubadora a 30 °C durante a oclusão.
2. Reperfusão e Pós-condicionamento Ácido (APC):
   1. Reanestesiar os animais com isoflurano conforme descrito acima, 55 min após o início da oclusão. Coloque e fixe os ratos em decúbito dorsal. Abra a incisão no pescoço e exponha novamente a artéria carótida comum.
   2. Puxe suavemente o filamento com uma pinça oftálmica após o período de oclusão para obter a reperfusão e transforme a sutura temporária em permanente, apertando o nó.
   3. Para o tratamento da acidose, troque o gás inalado pelo cone nasal para a mistura de gases contendo 20% de CO₂, 20% de O₂ e 60% de N₂ por 5 min em 5, 50 ou 100 min após a reperfusão. Feche a incisão com uma sutura cirúrgica interrompida.
   4. Coloque os ratos em uma gaiola de calor a 30 ° C até que eles recuperem a consciência e, em seguida, retorne os ratos para gaiolas limpas e individuais. Forneça aos ratos uma placa de Petri com água e comida umedecida. Monitore os camundongos de perto após a cirurgia quanto à dor excessiva e morte.

Materials