Imagem de transientes rápidos de cálcio em terminações nervosas de camundongos usando microscopia confocal

Resumo

Fonte: Zhilyakov, N. V. et. al., Registro de transientes de cálcio na junção neuromuscular de camundongo com alta resolução temporal usando microscopia confocal. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a técnica de imagem de registro de transientes rápidos de cálcio nas terminações nervosas usando microscopia confocal. Ao estimular o nervo e capturar alterações de fluorescência de corantes de ligação ao cálcio, ele visualiza o influxo dinâmico de cálcio e a depuração na terminação nervosa, oferecendo informações precisas sobre a atividade sináptica e a sinalização neuromuscular.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de revisão ética animal apropriado.

Experimentos foram realizados em preparações músculo-nervosas isoladas de elevador do auris longo (m. LAL) dos camundongos BALB/C (20-23 g, 2-3 meses de idade).

1. Preparação das soluções de Ringer e Lima

1. Prepare a solução de Ringer para o músculo de mamíferos misturando os seguintes ingredientes: cloreto de sódio, NaCl (137 mM), cloreto de potássio, KCl (5 mM), cloreto de cálcio, CaCl₂ (2 mM), MgCl₂ (1 mM), NaH₂PO₄ (1 mM), NaHCO₃ (11,9 mM) e glicose (11 mM). Borbulhar através da solução com 95% de oxigênio (O₂) e 5% de dióxido de carbono (CO₂) e ajustar seu pH para 7,2-7,4 adicionando ácido clorídrico / hidróxido de sódio (HCl / NaOH), se necessário.
2. Prepare a solução de carregamento de corante.
   1. Prepare a solução de ácido (4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanossulfônico (HEPES) (10 mM) com pH na faixa de 7,2-7,4. 500 μg de corante comercial vêm em um frasco de 500 μL. Dissolva o corante em 14 μL da solução HEPES para obter uma concentração de corante de 30 mM. Agite bem e centrifugue até dissolver totalmente.
   2. Diluir a solução do indicador Ca²⁺ com solução HEPES até uma concentração de 1 mM. Mantenha-o em um freezer (-20 °C) e evite a exposição à luz.

2. Procedimento de carregamento de corante

NOTA: O procedimento de carregamento de corante é realizado de acordo com o protocolo de carregamento através do coto nervoso, adaptado dos protocolos publicados anteriormente.

1. Dissecar o músculo LAL de acordo com o procedimento de dissecção para esta preparação, conforme descrito nos protocolos publicados anteriormente.
   1. Fixe o tecido levemente esticado (não mais do que 30% do comprimento inicial) na placa de Petri revestida com elastômero com pinos finos de aço inoxidável e adicione a solução de Ringer até que o músculo esteja totalmente coberto.
      NOTA: A placa de Petri foi pré-preenchida com elastômero de acordo com as instruções do fabricante (consulte a Tabela de Materiais).
2. Prepare a pipeta de enchimento
   1. Usando um extrator de micropipeta (consulte a Tabela de Materiais), prepare uma micropipeta com uma ponta fina que seja o mais afiada possível para os registros intracelulares. Use capilares sem filamentos internos (1,5 mm de diâmetro externo e 0,86 ou 1,10 mm de diâmetro interno).
   2. Quebre a ponta da micropipeta depois de marcar o cone com um abrasivo, deixando a ponta aberta com cerca de 100 μm de diâmetro. Polir a ponta com fogo até o limite quando o diâmetro interno diminuir de >80 μm para 12-13 μm. Conecte um tubo de silicone a um lado da pipeta de enchimento e uma seringa (sem agulha) ao outro lado.
3. Sob um estereomicroscópio, encontre o local onde o tronco nervoso se transforma em ramos nervosos separados. Coloque a pipeta de enchimento com o tubo montado e a seringa na placa de Petri usando cera. Mova a ponta da pipeta até que fique acima do nervo.
4. Com uma tesoura fina, corte o nervo próximo à fibra muscular, deixando um pequeno pedaço do coto nervoso com cerca de 1 mm de comprimento. Aspire suavemente o coto nervoso junto com um pouco de solução de Ringer, sem beliscá-lo, na ponta da pipeta de enchimento. Remova o tubo de silicone da pipeta de enchimento.
5. Retire alguma quantidade da solução de carregamento de corante (~ 0,3 μL) usando uma seringa com um filamento longo. Este volume corresponde a aproximadamente 3 cm do filamento.
   NOTA: Inicialmente, é necessário fazer um filamento a partir de uma ponta de pipeta com um volume de 10 μL puxando o fogo usando uma lâmpada de álcool ou um queimador a gás.
6. Insira cuidadosamente a ponta do filamento com a solução de carregamento na pipeta de enchimento. Solte a mistura diretamente no coto do nervo. Incube a preparação em temperatura ambiente no escuro por 30 min.
7. Em seguida, enxágue a preparação com solução de Ringer fresca e incube a 25 °C por até 2 h em um béquer de vidro com 50 mL (ou mais) de solução de Ringer (a preparação deve ser coberta com a solução). Durante esse tempo, o corante atingirá as sinapses.

3. Captura de vídeo com microscopia confocal

NOTA: O registro de transientes de cálcio é realizado com um microscópio confocal de varredura a laser (LSCM) (consulte a Tabela de Materiais). Para registrar transientes rápidos de cálcio, foi utilizado um protocolo original que permitia o registro de sinais com resolução espacial e temporal suficiente. O microscópio foi equipado com uma objetiva de imersão em água de 20x (abertura numérica de 1,00 (NA)). A linha de laser de 488 nm foi atenuada para 10% de intensidade e a fluorescência de emissão foi coletada de 503 a 558 nm.

1. Montar a preparação na câmara experimental revestida com elastómero de silicone e fixá-la, ligeiramente esticada, com um conjunto de microagulhas de aço. Enxágue extensivamente a preparação com solução de Ringer.
   NOTA: Foi utilizada uma câmara experimental de perfusão simples feita sob medida, feita de vidro orgânico, com o fundo da câmara coberto com um elastômero (preparado de acordo com as instruções do fabricante; ver Tabela de Materiais). A câmara possui um tubo de alimentação de solução. A solução é bombeada para fora através de uma agulha de seringa, montada em um suporte magnético (ver Tabela de Materiais). Como câmara experimental, pode-se usar uma placa de Petri (como a usada para incubação da preparação), mas com tubos de alimentação e sucção acoplados.
2. Instale um eletrodo de sucção, que será usado para estimular o nervo.
   NOTA: Coloque e fixe o eletrodo encerando-o ao lado do banho. Mova a ponta para perto do coto nervoso e aspire-a para o eletrodo.
3. Monte a câmara de preparação no microscópio stage e coloque as conexões de entrada e saída na câmara.
4. Para perfundir a preparação, use um sistema simples acionado por fluxo de gravidade. Ligue a bomba de sucção de perfusão para remover o excesso de solução.
5. Conecte o eletrodo de sucção estimulante a um estimulador elétrico e certifique-se de que as contrações musculares ocorram após a estimulação. Consulte as seções 3.9-3.12 para condições de estimulação e registro.
6. Encha o sistema de perfusão com a solução de Ringer com d-tubocurarina (10 μM).
   NOTA: Esta solução ajuda a prevenir contrações musculares. Os bloqueadores específicos de D-tubocurarina ou alfa-bungarotoxina dos receptores nicotínicos de acetilcolina na membrana pós-sináptica bloqueariam total ou parcialmente as contrações musculares50. Além disso, para prevenir contrações musculares, bloqueadores específicos dos canais de sódio pós-sinápticos, como a μ-conotoxina GIIIB, podem ser usados51.
7. Ligue a bomba de sucção de perfusão e inicie a perfusão da preparação com a solução de Ringer contendo d-tubocurarina.
8. Defina os parâmetros de imagem no software LSCM da seguinte forma.
   1. No software LSCM (LAS AF; consulte Tabela de Materiais), escolha Eletrofisiologia.
      NOTA: Neste modo, quando uma imagem é capturada no ponto de tempo, um pulso de sincronização é enviado ao estimulador com a ajuda da caixa de disparo. Isso provoca a geração de potencial de ação na preparação (Figura 1; unidade estimuladora).
   2. Selecione Modo de aquisição. Para acionar o estimulador usando o pulso de sincronização do microscópio, nas configurações do menu Trabalho, selecione as configurações do acionador. Defina o campo Trigger Out On Frame para o canal out1.
   3. Use as seguintes configurações: Modo de digitalização: XYT, Frequência de digitalização: 1400 Hz, Fator de zoom: 6.1, Pinhole: totalmente aberto. Certifique-se de que o modo X bidirecional de passagem transpassada sequencial esteja ativado.
   4. Defina o tempo mínimo para formar um quadro em 52 ms e os quadros a serem coletados em um vídeo bruto em 20 quadros.
      NOTA: Essas configurações permitem a captura de imagens com uma resolução de 128 x 128 pixels enquanto tira um único quadro a cada 52 ms.
   5. Defina o comprimento de onda de excitação do laser de argônio em 488 nm com 8% da potência de saída.

Pressione o botão Live Mode para alternar para o modo Live, o que ajuda a obter uma visualização dos terminais nervosos carregados com o corante.

9. Unidade de estimulação
   NOTA: Este dispositivo permite definir parâmetros temporais de estimulação através do software MATLAB.
   1. Crie um novo arquivo, cole o código do artigo mencionado acima na janela de código do MatLab e salve o arquivo. Clique em Executar, para que apareça uma janela com os parâmetros de estimulação. Defina o tempo de atraso e a duração do estímulo.
      NOTA: O atraso determina a resolução temporal do sinal fluorescente reconstituído. O pulso elétrico de 0,2 ms de duração é atrasado e depois enviado para a unidade de isolamento. Este último forma a amplitude e a polaridade do pulso estimulante e isola eletricamente o objeto biológico do equipamento de gravação.
   2. Para estimular o nervo, selecione a amplitude supramáxima do impulso estimulante (25%-50% maior que a intensidade máxima de estimulação necessária para ativar todas as fibras nervosas).
      NOTA: O método apresentado é baseado em um algoritmo especial para registro de sinais fluorescentes rápidos únicos usando LSCM com varredura minimizada. Em cada etapa do algoritmo desenvolvido, o sinal fluorescente registrado é deslocado do anterior por um intervalo de tempo menor que a varredura do microscópio. O valor das mudanças de tempo determina a resolução temporal do sinal necessário. O número de etapas (deslocamentos) no algoritmo depende da resolução temporal necessária e da resolução temporal original. Com este método de registro, a estimulação da preparação é realizada com uma frequência de 0,25 Hz.
10. No modo Ao vivo, procure o ROI e obtenha o melhor foco. Execute o software de aquisição de dados.
11. Desloque o atraso no estimulador em 2 ms a menos em relação ao valor anterior e execute o software de aquisição de dados.
12. Repita a etapa 3.11 26 vezes para adquirir 26 sequências, com cada sequência deslocada em 2 ms em relação à anterior.

Resultados

Figura 1: O esquema da configuração experimental. 1. Microscópio confocal de varredura a laser (LSCM). 2. Módulo de sincronização do LSCM (caixa de gatilho). 3. Estimulador. 4. Unidade de isolamento. 5. A amostra biológica. 6. Eletrodo de sucção para esti...

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