Entrega de medicamentos neuroterapêuticos baseados em bomba osmótica em um modelo de camundongo desmielinizado

Resumo

Fonte: Wang, X. et. al., Entrega de medicamentos baseada em bomba osmótica para pesquisa de remielinização in vivo no sistema nervoso central. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra o método de administração de medicamentos neuroterapêuticos usando uma bomba osmótica em um modelo de camundongo desmielinizado. A liberação controlada do medicamento promove a remielinização ativando as células produtoras de mielina no corpo caloso.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária do JoVE.

1. Estabelecimento do modelo de camundongo de desmielinização induzida por lisolecitina

1. Prepare a solução de lisolecitina a 1% (também chamada de L-α-lisofosfatidilcolina) com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS).
2. Esterilize tesouras, pinças, hemostáticos curvos e outros instrumentos cirúrgicos por esterilização em autoclave. Esterilize a área cirúrgica e coloque lençóis estéreis. Todos os materiais e reagentes utilizados para a cirurgia devem ser preparados assepticamente. É importante manter a área cirúrgica estéril durante todo o procedimento.
3. Anestesiar um pós-natal dia 56 (P56) C57BL6
   1. Coloque o mouse na câmara de isoflurano da máquina de anestesia para pequenos animais. Ajuste o fluxo de O₂ para 300-500 mL / min e o isoflurano para 3% -4%. Após anestesia suficiente, quando o camundongo ficar imóvel com uma respiração lenta e estável, transfira o camundongo para o aparelho estereotáxico com uma almofada de aquecimento.
   2. Mude a saída de gás da câmara para a máscara de anestesia e ajuste o isoflurano para 1% -1,5% para manter o camundongo no estado de anestesia. Espere até que o camundongo esteja totalmente anestesiado e, em seguida, injete cetoprofeno (3–5 mg / kg) por via intraperitoneal para aliviar a dor. Antes da operação, aperte os dedos dos pés do camundongo e verifique sua reação para confirmar o sucesso da anestesia.
   3. Quando o camundongo é anestesiado, ele não consegue regular a temperatura corporal. Portanto, monitore e regule a temperatura corporal do camundongo durante a cirurgia. Cubra a superfície dos globos oculares do camundongo com pomada ocular de eritromicina para mantê-los úmidos durante a anestesia.
4. Prenda a cabeça do mouse no aparelho estereotáxico com barra de dente e barras de ouvido. (Figura 1A).
5. Use uma navalha para remover os pelos do topo da cabeça. Higienize a pele da cabeça com três ciclos de betadina e etanol a 75%. Por questões éticas, cubra o corpo do animal, exceto o local da cirurgia. Usando um bisturi, faça uma incisão sagital média de 1 cm de comprimento da pele da base do pescoço até entre os olhos para expor o crânio (Figura 1B).
6. Limpe suavemente a superfície do crânio com um cotonete estéril contendo 30% de peróxido de hidrogênio para visualizar as suturas cranianas (Figura 1C). Ajuste a altura da barra do dente e das barras auriculares para colocar o ponto lambda e o ponto bregma na mesma altura (ou seja, com as mesmas coordenadas do eixo z quando a ponta da agulha toca os pontos), de modo que a sutura sagital fique horizontal.
7. Coloque suavemente a ponta da agulha da seringa de microlitro (10 μL, 33 G) no ponto bregma e redefina as coordenadas x, y e z para 0 (Figura 1D). Mova a seringa para o local da injeção (x: 1,04; y: 1,0, ou seja, 1,04 mm lateral à linha média e 1,0 mm posterior ao ponto bregma) de acordo com o prompt da leitura digital (Figura 1E).
8. Faça lentamente um pequeno orifício no crânio no local da injeção sem penetrar na dura-máter com uma agulha de seringa de 1 mL (26 G, 0,45 mm) (Figura 1F). Insira lentamente a agulha da seringa de microlitro no tecido cerebral através do orifício até atingir uma certa profundidade (z = -1,62 mm para a maioria dos camundongos P56) (Figura 1G).
   NOTA: Empiricamente, a profundidade de inserção de -1,62 mm permite que a ponta da agulha alcance o meio do corpo caloso da maioria dos camundongos P56 para que a lisolecitina possa ser entregue diretamente ao corpo caloso para induzir a desmielinização.
9. Injete 1,5 μL de lisolecitina a 1% a uma velocidade de 0,3 μL/min. Após a injeção, aguarde 5 minutos antes de retirar lentamente a seringa de microlitros para evitar vazamento de líquido ao longo do caminho da agulha de injeção.
10. Costure a pele com pontos cirúrgicos 5-0 (Figura 1H).
11. Coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para evitar uma queda na temperatura corporal. Administre uma injeção subcutânea de 5 mg/kg de carprofeno a cada 24 horas para aliviar a dor. Aplique pomada de eritromicina na incisão todos os dias para garantir que a ferida cicatrize adequadamente. Coloque o camundongo que foi submetido à cirurgia sozinho em uma gaiola e alimente-o com comida úmida até que esteja totalmente recuperado. Monitore o mouse diariamente após a operação.

2. Preparação da bomba osmótica

NOTA: Os principais componentes da bomba são mostrados na Figura 2A.

1. Determine a profundidade de inserção da cânula de infusão cerebral no cérebro. Certifique-se de que a agulha da cânula de infusão cerebral usada tenha 3 mm de comprimento e cada espaçador de ajuste de profundidade tenha 0,5 mm. Para atingir uma profundidade de injeção de 1,5 mm (perto do caloso), coloque três espaçadores de ajuste de profundidade na agulha da cânula de infusão cerebral com adesivo tecidual (Figura 2B, C).
2. Para encher a bomba osmótica, conecte a agulha da seringa que acompanha a embalagem da bomba a uma seringa de 1 mL e aspire o medicamento. Segure a bomba na vertical, insira a seringa na abertura na parte superior da bomba e injete lentamente o medicamento, tomando cuidado para não criar bolhas (ver Figura 2D). Quando o líquido sair pela abertura, puxe lentamente a seringa.
3. Remova o flange branco do regulador de fluxo com uma tesoura ou alicate, tomando cuidado para não dobrar ou esmagar o moderador de fluxo. Em seguida, insira o moderador de fluxo na bomba (Figura 2E). Para determinar se há bolhas na bomba osmótica, pese a bomba osmótica separadamente antes e depois do enchimento.
4. Apare o cateter em um determinado comprimento de acordo com o tamanho do animal (cateteres de 20-25 mm para camundongos P56 que pesam cerca de 25 g). Conecte o cateter à cânula de infusão cerebral.
5. Encha o cateter com medicamentos usando a seringa sem introduzir ar (Figura 2F).
6. Conecte o cateter ao moderador de fluxo. Após a fixação, certifique-se de que o cateter cobre cerca de 4 mm do moderador de fluxo exposto (Figura 2G).
7. Para garantir que a bomba osmótica possa funcionar instantaneamente após a implantação, mergulhe as bombas cheias em solução salina estéril a 0,9% ou PBS a 37 ° C por pelo menos 4 a 6 h (de preferência estender durante a noite) para pré-umedecer a membrana semipermeável na superfície da bomba com soluções que tenham a mesma pressão osmótica que o ambiente do tecido ( Figura 2H ).
8. Todas as soluções carregadas nas bombas devem ser estéreis. As bombas ALZET são fornecidas estéreis, tendo sido expostas a uma dose esterilizante de cobalto-60. No entanto, se ocorrer contaminação externa, a superfície da bomba pode ser limpa limpando-a com álcool isopropílico (70% em água).

3. Implante da bomba osmótica

1. Aguardar 3 dias após o estabelecimento do modelo de desmielinização do corpo caloso. Ligue o sistema de anestesia para pequenos animais. Desinfete tesouras, pinças e alicates hemostáticos e mergulhe-os em solução alcoólica a 75%. Coloque lençóis estéreis na área cirúrgica.
2. Anestesiar e prender os ratos no aparelho estereotáxico novamente. Cubra a superfície dos globos oculares com uma pomada para evitar o ressecamento.
3. Desinfete a ferida original com álcool 75%. Abra a incisão cirúrgica previamente suturada (Figura 3A) e expanda a incisão até as omoplatas (Figura 3B).
4. Separe a pele do tecido conjuntivo subcutâneo com um alicate hemostático ou pinça na escápula para abrir uma cavidade (Figura 3C). Coloque a bomba osmótica na cavidade (Figura 3D, E).
5. Com um cotonete, limpe suavemente e exponha o orifício na superfície do crânio criado ao estabelecer o modelo de desmielinização (consulte a etapa 1.8). Insira a cânula de infusão cerebral através deste orifício perpendicularmente e prenda-a rapidamente no crânio com adesivo de tecido (Figura 3F).
6. Remova a aba removível acima da cânula de infusão cerebral com uma tesoura (Figura 3G, H). Como alternativa, remova a aba antes de inserir a cânula para evitar tremores durante esse processo.
7. Costure a incisão ou prenda-a com adesivo de tecido (Figura 3I).
8. Após a cirurgia, coloque o mouse em uma almofada de aquecimento para evitar uma queda na temperatura corporal. Administre uma injeção subcutânea de 5 mg/kg de carprofeno a cada 24 horas para aliviar a dor. Aplique pomada de eritromicina na incisão todos os dias para garantir que a ferida cicatrize adequadamente. Coloque o animal sozinho em uma gaiola e alimente-o com comida úmida até que esteja totalmente recuperado.

Resultados

Figura 1: Estabelecimento do modelo de camundongo de desmielinização induzida por lisolecitina. (A) Prenda o mouse no aparelho estereotáxico. (B) Abra uma incisão sagital média de 1 cm para expor o crânio. (C

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bomba de ar de anestesia	RWD	R510-29	E05818-006
Kit de infusão cerebral 3	ALZET	8851	1-3 mm
Carprofeno	Macklin	C830557-1g	5 mg/kg a cada 24 h
Olho de eritromicina pomada	Ao longo da tecnologia	YCKJ-RJ-024780	Cubra a superfície dos globos oculares durante a anestesia
Pomada de eritromicina	pythonbio	RG180
Aparelho de evacuação de gás	RWD	R546W	E05518-002
L-α-lisofosfatidilcolina	Sigma	L0906	Dissolva a 1% com seringa estéril PBS
Microlitro	Hamilton	65460-05	Série de seringas:1700, 10 μL, calibre 33
Bomba micro-osmótica modelo 1002	ALZET	4317	0,25 μL por hora, 14 dias
PBS (pH = 7,3)	ORIGENE	ZLI-9061
Pentobarbital sódico	Shanghai Civi	Nº CAS: 57-33-0	150-200 mg/kg injeção intraperitoneal para eutanásia
Máquina de anestesia para pequenos animais	RWD	R520IE	E05807-006 M
Equipamento estereotáxico	RWD	E06382
STERI 250 esterilizador	Keller	31101	Esterilização rápida de instrumentos cirúrgicos
Suturas cirúrgicas	Shanghai jinhuan	F504	5-0
Agulha de seringa (1 mL)	Shanghai KDL	6930197811018	calibre 26 (0,45 mm x 16 mm)
Medicamento de teste e solvente	Dependente do experimento	N/A
Sistema de monitoramento homeotérmico Thermostar	RWD	69026	Manter a temperatura corporal durante a anestesia
Adesivo tecidual Vetbond	3M	1469SB	Prenda a cânula de infusão cerebral e adira a incisão na pele