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Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Seleção de Sujeito
- Seleção de pacientes para protocolo de pesquisa.
- Identifique pacientes com epilepsia ativa (convulsões no último ano) ou histórico de epilepsia remota (convulsões anteriores, mas sem convulsões nos últimos cinco anos com ou sem medicação) e heterotopia nodular periventricular em imagens cerebrais estruturais.
- Exclua pacientes sem história de convulsões. Além disso, exclua pacientes com possíveis etiologias alternativas para convulsões (por exemplo, história de traumatismo cranioencefálico, acidente vascular cerebral (AVC), meningoencefalite) ou com achados de EEG consistentes com um diagnóstico alternativo (por exemplo, epilepsia generalizada idiopática, epilepsia do lobo temporal mesial).
- Exclua pacientes com doença neurológica ou psiquiátrica adicional ou com qualquer outra condição médica instável. Além disso, exclua pacientes com história de cirurgia cerebral prévia, incapacidade de tolerar ressonância magnética (RNM), uso recente de substâncias ilícitas ou bebidas alcoólicas pesadas ou uma contraindicação específica de RNM ou EMT.
- Seleção de sujeito de controle saudável.
- Para cada paciente com heterotopia nodular periventricular (HPN) (em nosso estudo publicado anteriormente, 8 pacientes, com idades entre 20 e 43 anos, média de 30,25; 3 homens, 5 mulheres), identifique um controle saudável pareado por idade e sexo.
- Excluir indivíduos com qualquer doença neurológica ou psiquiátrica em andamento ou em uso de medicamentos psicoativos, qualquer outra condição médica instável, histórico de cirurgia cerebral anterior, incapacidade de tolerar ressonância magnética, substância ilícita ou uso pesado de álcool ou qualquer outra contraindicação específica de ressonância magnética ou EMT.
2. Gerando os alvos de estimulação
- Usando um sistema de ressonância magnética 3T, adquira fatias estruturais de todo o cérebro de alta resolução usando uma sequência ponderada em T1. Use os seguintes parâmetros de aquisição: 128 cortes por placa, uma matriz de 256 x 256, campo de visão (FOV) 256 mm, espessura do corte 1,33 mm com intervalo entre cortes de 0,63 mm, tamanho do voxel 1 x 1 x 1,33 mm3, tempo de repetição (TR) 2.530 mseg, tempo de inversão 1.100 ms, tempo de eco (TE) 3,39 ms, ângulo de inversão 7°.
- Usando um sistema de ressonância magnética 3T, adquira imagens funcionais em estado de repouso usando uma sequência ecoplanar sensível ao contraste dependente do nível de oxigenação do sangue (BOLD). Ao realizar este exame, instrua os pacientes a descansar em silêncio com os olhos abertos sem realizar nenhuma tarefa específica. Use os seguintes parâmetros de aquisição: FOV 256 mm, tamanho do voxel 2,0 x 2,0 x 2,0 mm, TR 6.000 mseg, TE 30 mseg, ângulo de inversão 90°, tempo de aquisição 6,4 min.
- Usando o software MRICroN, identifique cada região discreta de heterotopia nodular (cada nódulo individual ou um aglomerado contíguo inseparável de nódulos). Use a ferramenta Caneta para delinear manualmente as regiões de interesse (ROIs) de heterotopia, fatia por fatia no plano axial em imagens estruturais ponderadas em T1.
- Use a caixa de ferramentas do software de conectividade funcional CONN para executar quatro etapas sequenciais no processamento de dados funcionais em estado de repouso: Configuração, Pré-processamento, Análise e Resultados.
- Para Configuração, use as opções de menu para iniciar um novo projeto e inserir informações básicas do experimento. Carregue as imagens funcionais, realinhadas e co-registradas nas imagens anatômicas de cada sujeito.
- Carregue as imagens estruturais. Carregue os arquivos ROI de heterotopia criados na etapa 2.3. Insira os detalhes da condição experimental; Como este é um estado de repouso, insira uma única condição com início de 0 segundos e duração igual à duração completa de cada sessão. A caixa de ferramentas extrairá a série temporal heterotopia ROI BOLD. Inspecione possíveis inconsistências.
- Para o pré-processamento, as fontes de confusão da variação BOLD incluem modulações induzidas pela respiração do campo magnético principal e pulsações cardíacas, bem como o movimento do sujeito. Remova os fatores de confusão por meio do método integrado baseado em componentes principais que analisa dados de séries temporais de regiões improváveis de estarem associadas à atividade neural, como ventrículos e grandes vasos, para identificar processos de ruído fisiológico. Visualize a variação total explicada por cada uma das possíveis fontes de confusão. Aplique um filtro de frequência passa-banda (0,01 Hz < f < 0,1 Hz) e suavização gaussiana (6 mm de largura total na metade do máximo).
NOTA: A caixa de ferramentas identificará, por padrão, as fontes de possíveis fatores de confusão, incluindo o sinal BOLD da substância branca e do líquido cefalorraquidiano e os parâmetros de realinhamento (movimento do sujeito). - Para Análise e Resultados, identifique as fontes de interesse como os ROIs de heterotopia. Visualize a medida de conectividade de correlação (em vez de regressão) e exiba usando valores de limite para coeficientes de correlação.
- Para cada assunto, crie mapas de conectividade de semente para voxel utilizando cada região discreta da substância cinzenta heterotópica como uma ROI inicial, demonstrando a correlação entre a série temporal média do sinal BOLD da ROI e todos os outros voxels cerebrais.
- Realize análises de segundo nível para contrastes entre sujeitos ou entre fontes (opcional). Exiba os resultados usando os limites de altura (nível de voxel) e extensão (nível de cluster); valores p corrigidos por taxa de descoberta não corrigida e falsa são mostrados.
- Use o software MRICroN para delinear manualmente dois alvos de interesse, um alvo conectado e um destino não conectado, para TMS, usando a ferramenta Caneta. Usando a função "Sobreposição", sobreponha os mapas de conectividade funcional criados acima nas imagens estruturais de cada assunto.
- Certifique-se de que a região alvo seja uma região do córtex que tenha conectividade funcional significativa com a heterotopia da substância cinzenta, conforme descrito acima. Certifique-se de que o alvo não conectado seja uma região de tamanho semelhante que não demonstre conectividade funcional significativa com qualquer ROI de heterotopia e esteja localizado a pelo menos 2,5 cm de distância do alvo conectado na superfície cortical para minimizar o risco de efeitos de estimulação da vizinhança durante o TMS.
- Escolha alvos de forma que a probabilidade de grandes artefatos induzidos por EMT seja pequena. Especificamente, evite selecionar alvos nas regiões temporais laterais ou frontopolares, pois é provável que produzam grandes contrações musculares e/ou artefatos de movimento ocular que podem obscurecer o sinal inicial do TMS-EEG. Salve as metas descritas como novos ROIs de destino.
- Determine as coordenadas do MNI (Montreal Neurological Institute) para cada ROI alvo em cada sujeito. Em seguida, use essas coordenadas para identificar os dois locais-alvo equivalentes no sujeito de controle saudável correspondente de cada sujeito.
3. Configuração experimental do TMS-EEG
- Carregue varreduras estruturais (normalmente imagens volumétricas 3D ponderadas em T1 de alta resolução) no sistema de neuronavegação.
- Usando o software de neuronavegação, marque os alvos desejados nas imagens. Marque também marcadores anatômicos externos (o násio, tragus bilateral) que serão usados para co-registro e neuronavegação durante a sessão de estimulação. Se estiver usando uma touca de EEG com eletrodos giratórios e fios de eletrodos, oriente os fios perpendicularmente ao eixo longo da bobina TMS52.
- Entre em contato com o sujeito antes da sessão experimental para lembrá-lo de não usar condicionadores ou outros produtos capilares (xampu é aceitável) no dia da sessão de TMS-EEG, evitar bebidas alcoólicas na noite anterior à sessão de TMS-EEG e beber seu consumo diário habitual de cafeína antes da sessão de TMS.
4. Sessão Experimental
- Confirme se o sujeito passa nos critérios de segurança da EMT, idealmente por meio de um questionário estruturado. Confirme se o sujeito não consumiu bebidas alcoólicas na noite anterior, não bebeu significativamente mais ou menos do que seu consumo diário habitual de cafeína, não consumiu soníferos de venda livre que alteram a excitabilidade cortical (como difenidramina) na noite anterior e recebeu uma noite de sono típica (já que a privação do sono pode aumentar a excitabilidade cortical).
- Peça ao sujeito para se sentar em uma cadeira confortável.
- Monte a tampa do EEG no assunto e prepare os eletrodos.
- Meça a cabeça do sujeito e selecione uma touca de EEG de tamanho apropriado para ajudar a permitir baixas impedâncias de eletrodos.
- Limpe completamente a pele sob cada eletrodo usando um aplicador de ponta de algodão e álcool.
- Adicione gel condutor a cada eletrodo. Não adicione muito gel para que vaze entre os eletrodos, pois isso pode criar uma ponte e levar a um sinal comum entre diferentes eletrodos.
- Se necessário, para garantir um bom contato entre o couro cabeludo, o gel e o eletrodo, tente pressionar cada eletrodo após adicionar o gel. Para minimizar os artefatos de carregamento, certifique-se de que o gel não se espalhe para fora do suporte do eletrodo. Reduziu homogeneamente os níveis de condutância para minimizar os artefatos de gravação.
- Coloque os eletrodos de referência e terra o mais longe possível da bobina de estimulação para minimizar a possibilidade de o artefato do eletrodo induzido por TMS contaminar toda a gravação. É preferível colocar esses eletrodos acima das estruturas ósseas, em zonas presumivelmente "inativas" com atividade cortical mínima.
NOTA: Mesmo em estudos para os quais os locais-alvo são variáveis, é improvável que as regiões frontopolares sejam selecionadas como alvos, pois a EMT para essas regiões pode resultar em grandes movimentos oculares, contração dos músculos frontais e faciais, e, frequentemente, dor no couro cabeludo e dor de cabeça; consequentemente, o sinal TMS-EEG durante a estimulação dessas regiões é frequentemente obscurecido por grandes artefatos. - Como é improvável que essas regiões sejam escolhidas como alvos para estimulação, use a testa para a colocação dos eletrodos de referência e terra. Coloque-os a poucos centímetros um do outro para minimizar o ruído de modo comum.
NOTA: Em situações em que todos os alvos de estimulação estão em um hemisfério, a mastóide contralateral seria outra opção. - Verifique as impedâncias do eletrodo da seguinte forma: conecte os cabos de saída de EEG no conector de "impedância" do sistema de gravação de EEG e, em seguida, pressione o botão "medir impedâncias" no sistema de EEG. Certifique-se de que a impedância do eletrodo não seja superior a 5 kΩ.
- Prepare os eletrodos EMG na mão contralateral (use os primeiros músculos interósseos dorsais ou abdutores curtos do polegar; utilize o mesmo músculo entre os indivíduos em um único estudo).
- Dê tampões de ouvido ao sujeito para minimizar o risco de perda auditiva e zumbido.
NOTA: Outra opção seria utilizar fones de ouvido que reproduzem ruído branco ou ruído colorido (com características espectrais correspondentes às do clique TMS) durante todo o processo de gravação, em um volume suficiente para mascarar o clique auditivo produzido pelo TMS; isso teria o benefício adicional de minimizar o potencial de confusão dos potenciais evocados auditivos induzidos por TMS. É importante notar que uma fina camada de espuma entre a bobina e o couro cabeludo também é necessária para minimizar o potencial evocado auditivo. - Coloque os detectores infravermelhos na cabeça do sujeito, garantindo que os detectores sejam colocados de forma a minimizar o risco de movimento durante a sessão experimental.
- Registre a cabeça do sujeito com as imagens de ressonância magnética, identificando a localização dos marcadores fiduciais anatômicos externos pré-selecionados (seção 3.2) no sujeito usando o ponteiro que acompanha o equipamento de neuronavegação.
- Familiarize o sujeito com a estimulação aplicando um pulso em outro lugar (por exemplo, o braço do sujeito) ou aplicando um pulso de estimulação de baixa intensidade (por exemplo, 5% da saída máxima do estimulador) no couro cabeludo.
- Determine o limiar motor em repouso (a intensidade mínima que produz um potencial evocado motor de pelo menos 50 μV em tamanho em 5/10 tentativas). Um desses métodos, o método da frequência relativa, é o seguinte.
- Determine a localização do córtex motor do sujeito no hemisfério ipsilateral aos alvos baseados em conectividade de fMRI. Ao usar a neuronavegação, isso geralmente ocorre na região do "Ômega" no giro pré-central. Incline a bobina perpendicularmente ao giro, com a alça apontando occipitalmente.
- Comece a estimulação em uma intensidade que se espera que seja abaixo do limiar (por exemplo, 35% da saída máxima do estimulador).
- Aumente a intensidade da estimulação em etapas de 5% da saída máxima do estimulador até que o TMS evoque consistentemente os potenciais evocados motores (MEPs) com amplitudes > 50 μV em cada tentativa.
- Em seguida, diminua a intensidade da estimulação em etapas de 1% da saída máxima do estimulador até que menos de 5 respostas positivas de 10 sejam registradas.
NOTA: Esta intensidade de estimulação mais 1 é definida como o limiar motor. Como alternativa, use técnicas de limiar adaptativo para identificar o limiar motor com menos estímulos.
- Para estimulação das áreas-alvo, defina a intensidade do TMS para o valor desejado (por exemplo, 120% do limiar motor em repouso).
NOTA: No entanto, nos casos em que há variações regionais significativas na distância couro cabeludo-córtex (por exemplo, em pacientes com atrofia do lobo frontal), tal técnica pode resultar em estimulação subliminar. Alternativamente, com sistemas de neuronavegação apropriados capazes de realizar estimativas on-line do campo elétrico induzido, a intensidade da estimulação também pode ser definida em uma amplitude específica do campo elétrico induzido calculado (em V / m) na superfície cortical. - Aplique pulsos únicos de TMS em cada uma das regiões-alvo usando o software de neuronavegação, com um intervalo variável entre os pulsos para minimizar a plasticidade cortical e os efeitos de expectativa do sujeito (por exemplo, a cada 4 - 6 segundos, com um intervalo de pelo menos 3 segundos para evitar efeitos cumulativos). Para maximizar a consistência, incline a bobina perpendicularmente ao eixo longo do giro subjacente, com a alça apontada posterolateralmente.